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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 是个小白，求助关于pcr，跑电泳，没p出条带，点样孔会亮。
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俊锋

新虫 (初入文坛)

[求助] 是个小白，求助关于pcr，跑电泳，没p出条带，点样孔会亮。 已有4人参与

做5‘RACE   PCR
提取植物的RNA后，用Smart试剂盒反转录出cDNA，以cDNA为模板，做pcr，没p出条带，点样孔会亮，做了两次pcr，两次都出现这种情况
第一次做pcr的时候用了两个模板，退火温度是70与64，点样孔没亮；温度是60与55，点样孔会亮的。
第二次做pcr，希释一个模板，做温度梯度pcr，温度设在63  61.4  58.9  56  53.5  51.9  51度，63度点样孔没亮，其他的都亮了，没p出条带。
其他师姐他们用同一个pcr仪可以p出条带。
现在做这个实验换了几次试剂盒，再做下去老师的钱都被我用光了。
求个位大神帮帮忙忙

是个小白，求助关于pcr，跑电泳，没p出条带，点样孔会亮。
第二次pcr电泳图
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1楼 2016-01-11 10:19:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

反应链

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 俊锋 at 2016-01-11 11:23:07
RNA跑电泳的时候，28s与18s比较亮便用做模板，5s不怎么亮...

How about your positive control, which used the cDNA template for housekeeping gene amplification, such as Actin?
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6楼2016-01-11 11:38:57
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奇怪人生123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2016-01-12 20:41:56
看图片 猜测是堵孔了   想知道楼主配PCR的反应体系 尤其是cDNA的量（不能多） 以及扩增的循环数
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实时荧光定量PCR（TaqMan探针法）欢迎和大家探讨~
2楼2016-01-11 10:48:41
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反应链

新虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2016-01-12 20:42:07
How was the quality of your RNA extracted?

I think your PCR templates were rich in poly/oligosaccharides, polyphenols and other unknown sticky compounds that bind or co-precipitae with DNA and form a viscous complex. Such DNA sample is usually neither suitable for PCR amplification nor even possible to load into the electrophoresis well.
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3楼2016-01-11 10:59:15
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人小红花或者玫瑰，手有余香，俺期待您更多精彩。 2016-01-12 20:42:19
你的RNA和cDNA怎么样，如果没问题，先做一遍试剂盒里的阳性对照。
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8楼2016-01-11 11:49:26
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普通回帖

俊锋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 奇怪人生123 at 2016-01-11 10:48:41
看图片 猜测是堵孔了   想知道楼主配PCR的反应体系 尤其是cDNA的量（不能多） 以及扩增的循环数

扩增循环数：25   cDNA的量用的是 ：SMART试剂盒做出之后，用90ul EDTA稀释后，加2.5ul cDNA为模板。
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4楼2016-01-11 11:17:45
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俊锋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 10:59:15
How was the quality of your RNA extracted?

I think your PCR templates were rich in poly/oligosaccharides, polyphenols and other unknown sticky compounds that bind or co-precipitae with DNA and fo ...

RNA跑电泳的时候，28s与18s比较亮便用做模板，5s不怎么亮
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5楼2016-01-11 11:23:07
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俊锋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 俊锋 at 2016-01-11 11:23:07
RNA跑电泳的时候，28s与18s比较亮便用做模板，5s不怎么亮...

跑RNA电泳的时候却RNA可以跑出来，cDNA跑电泳的时候，也有尼散的条带。还是说杂质一直在RNA那里，然后在DNA量太多了然后跑不出来吗
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7楼2016-01-11 11:42:24
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俊锋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-01-11 11:49:26
你的RNA和cDNA怎么样，如果没问题，先做一遍试剂盒里的阳性对照。

阳性对照是为了检测目的在于检测什么的啊？
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9楼2016-01-11 12:02:03
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俊锋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hanxiaominhu at 2016-01-11 11:49:26
你的RNA和cDNA怎么样，如果没问题，先做一遍试剂盒里的阳性对照。

RNA跑电泳的时候，比较亮，条带与师兄师姐做pcr的一样，就是没有做个OD260/0D280比较，所以没能准确地说RNA模板没问题。
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10楼2016-01-11 12:07:15
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