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俊锋

新虫 (初入文坛)

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[求助] 是个小白，求助关于pcr，跑电泳，没p出条带，点样孔会亮。已有4人参与

做5‘RACE PCR
提取植物的RNA后，用Smart试剂盒反转录出cDNA，以cDNA为模板，做pcr，没p出条带，点样孔会亮，做了两次pcr，两次都出现这种情况
第一次做pcr的时候用了两个模板，退火温度是70与64，点样孔没亮；温度是60与55，点样孔会亮的。
第二次做pcr，希释一个模板，做温度梯度pcr，温度设在63 61.4 58.9 56 53.5 51.9 51度，63度点样孔没亮，其他的都亮了，没p出条带。
其他师姐他们用同一个pcr仪可以p出条带。
现在做这个实验换了几次试剂盒，再做下去老师的钱都被我用光了。
求个位大神帮帮忙忙

第二次pcr电泳图

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1楼 2016-01-11 10:19:05

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俊锋

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 奇怪人生123 at 2016-01-11 10:48:41
看图片猜测是堵孔了想知道楼主配PCR的反应体系尤其是cDNA的量（不能多）以及扩增的循环数

扩增循环数：25 cDNA的量用的是：SMART试剂盒做出之后，用90ul EDTA稀释后，加2.5ul cDNA为模板。

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4楼2016-01-11 11:17:45

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俊锋

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3楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 10:59:15
How was the quality of your RNA extracted?

I think your PCR templates were rich in poly/oligosaccharides, polyphenols and other unknown sticky compounds that bind or co-precipitae with DNA and fo ...

RNA跑电泳的时候，28s与18s比较亮便用做模板，5s不怎么亮

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5楼2016-01-11 11:23:07

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