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俊锋

新虫 (初入文坛)

[求助] 是个小白,求助关于pcr,跑电泳,没p出条带,点样孔会亮。 已有4人参与

做5‘RACE   PCR
提取植物的RNA后,用Smart试剂盒反转录出cDNA,以cDNA为模板,做pcr,没p出条带,点样孔会亮,做了两次pcr,两次都出现这种情况
第一次做pcr的时候用了两个模板,退火温度是70与64,点样孔没亮;温度是60与55,点样孔会亮的。
第二次做pcr,希释一个模板,做温度梯度pcr,温度设在63  61.4  58.9  56  53.5  51.9  51度,63度点样孔没亮,其他的都亮了,没p出条带。
其他师姐他们用同一个pcr仪可以p出条带。
现在做这个实验换了几次试剂盒,再做下去老师的钱都被我用光了。
求个位大神帮帮忙忙

是个小白,求助关于pcr,跑电泳,没p出条带,点样孔会亮。
第二次pcr电泳图
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反应链

新虫 (正式写手)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2016-01-12 20:42:07
How was the quality of your RNA extracted?

I think your PCR templates were rich in poly/oligosaccharides, polyphenols and other unknown sticky compounds that bind or co-precipitae with DNA and form a viscous complex. Such DNA sample is usually neither suitable for PCR amplification nor even possible to load into the electrophoresis well.
3楼2016-01-11 10:59:15
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奇怪人生123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2016-01-12 20:41:56
看图片 猜测是堵孔了   想知道楼主配PCR的反应体系 尤其是cDNA的量(不能多) 以及扩增的循环数
实时荧光定量PCR(TaqMan探针法)欢迎和大家探讨~
2楼2016-01-11 10:48:41
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俊锋

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 奇怪人生123 at 2016-01-11 10:48:41
看图片 猜测是堵孔了   想知道楼主配PCR的反应体系 尤其是cDNA的量(不能多) 以及扩增的循环数

扩增循环数:25   cDNA的量用的是 :SMART试剂盒做出之后,用90ul EDTA稀释后,加2.5ul cDNA为模板。
4楼2016-01-11 11:17:45
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俊锋

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 反应链 at 2016-01-11 10:59:15
How was the quality of your RNA extracted?

I think your PCR templates were rich in poly/oligosaccharides, polyphenols and other unknown sticky compounds that bind or co-precipitae with DNA and fo ...

RNA跑电泳的时候,28s与18s比较亮便用做模板,5s不怎么亮
5楼2016-01-11 11:23:07
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