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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么两次PCR做的结果不一致？
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小鼹鼠

木虫 (小有名气)

[求助] 为什么两次PCR做的结果不一致？ 已有3人参与

筛双交换的，第一遍PCR有条带，第二遍PCR重复，结果就没有条带了。这是什么原因呢？我肯定没加错样。。太坑了……
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天道酬勤
1楼 2015-08-06 20:27:06
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那就是你的操作有问题，PCR需要很细心，稍微出点错，有可能就P不出来。
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2楼2015-08-07 08:23:14
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
淡定淡定，正常，二次PCR本身错配就较高，因此总是会出现问题，只能想办法提高扩增的特异性了，可以看看这篇文章（http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html）此外注意上样量，二次扩增模板要稀释1000倍左右也很重要，好运喽~
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-08-07 09:43:10
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小鼹鼠

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-08-07 09:43:10
淡定淡定，正常，二次PCR本身错配就较高，因此总是会出现问题，只能想办法提高扩增的特异性了，可以看看这篇文章（http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html）此外注意上样量，二次扩增模板要 ...

不是二次扩增，就是再做第二遍。比如上午做了一锅有条带，下午再做就没条带了。搞不懂是为什么。有的时候是这样，第一次条带很亮，第二次条带就很弱了。
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天道酬勤
4楼2015-08-10 19:25:53
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布za

铜虫 (初入文坛)
我把质粒转到BL21后菌液pcr验证也遇到第一次p有条带，再p一次没有了，并且pcr提质粒用的DH5a也没有条带了，原因到现在都还没弄明白
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5楼2015-08-13 20:51:25
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新一基德

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

操作问题吧，确定两次都完全一样？按理说既然第一次P出来第二次就不该有问题的啊。
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6楼2015-08-14 09:48:44
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小鼹鼠 at 2015-08-10 19:25:53
不是二次扩增，就是再做第二遍。比如上午做了一锅有条带，下午再做就没条带了。搞不懂是为什么。有的时候是这样，第一次条带很亮，第二次条带就很弱了。...

分子生物本身就看不见摸不着啊，存在很大偶然性的，上午做有，下午没有条带，也可能是上午温度低，下午温度又高了呢，或者是加样时间长了一点点，这样温度时间的轻微变化都会引起酶等其他的活性变化啊，当然只是针对普通的Taq酶，如果是热启动酶就不会啦~
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-08-31 16:39:03
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DT0221

新虫 (初入文坛)
你的PCR体系多少呢？小体系误差比较大，比如10ul、20ul的。特别容易重复不出来。最少体系20ul吧。
另外你的引物特异性好不好？多长？如果和模板重叠了20以上，并且特异性好，应该没问题的。
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8楼2015-08-31 17:06:53
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启从QICONG

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-08-31 16:39:03
分子生物本身就看不见摸不着啊，存在很大偶然性的，上午做有，下午没有条带，也可能是上午温度低，下午温度又高了呢，或者是加样时间长了一点点，这样温度时间的轻微变化都会引起酶等其他的活性变化啊，当然只是针 ...

配PCR的体系时间的长短对p出来的效果还有影响吗？
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9楼2015-09-01 09:03:54
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
9楼: Originally posted by 启从QICONG at 2015-09-01 09:03:54
配PCR的体系时间的长短对p出来的效果还有影响吗？...

当然有影响，温度对酶的影响，可能影响不大，但是可以从结果判断啊，你扩增不出来条带，说明就有影响呗，前提是使用试剂什么的全部都没有变。
如果不是热启动酶，普通的酶要在冰上配置反应体系，分子实验，还是注意规范操作，不然难找原因啊~
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-09-01 09:34:57
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