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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？
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merfect

新虫 (初入文坛)

[求助] 内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？ 已有3人参与

本人菜鸟一枚。用荧光PCR。原来用的这个内参做大鼠细胞，按照50度2min预变性，95度15min变性，95度10s，60度32s退火，40循环然后熔解，做的都很好。现在换成骨髓，就做的很差。为什么啊？求分析。图在下面。
细胞的时候CT值23，扩增熔解都很好。
第一次，退火62度32s，CT值31，扩增很好，熔解不好。
第二次，用了三步法，条件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循环然后熔解，CT值28，扩增好，熔解不好，双峰。是引物二聚体吗？还是非特异性扩增呢？
第三次，改回两步法，改为原来的60度32s，CT值24，扩增好，熔解不好。还是双峰。
第四次，两步法，条件没变，我最开始以为是骨髓提RNA，逆转录过程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，结果还是这样。CT值24，扩增好，熔解还是双峰。
请问一下，这是什么原因呢？为什么GAPDH会做成这样呢？和引物有关系吗？我需要重新设计引物吗？原来用大鼠细胞的时候这个引物是可以的啊，现在换成骨髓就不能用了吗？或者，还需要改变什么条件才能变成单峰呢？

多谢多谢！

内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？
第一次扩增，62度32s，CT值31.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-1
第一次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-2
第二次扩增，三步法，CT值28.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-3
第二次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-4
第三次扩增，60度32s，CT值24.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-5
第三次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-6
第四次扩增，换了新的cDNA，CT值24.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-7
第四次熔解.jpg
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1楼 2014-05-13 21:04:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
GAPDH是多拷贝，在基因组里有很多高度同源的序列，你设计引物不BLAST检验吗？
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2楼2014-05-14 08:49:00
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merfect

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-14 08:49:00
GAPDH是多拷贝，在基因组里有很多高度同源的序列，你设计引物不BLAST检验吗？

还不太会用blast啊。用那个检验gapdh大鼠序列，e值都在0.05左右，可以吗？是不是还需要看别的结果啊？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-05-14 16:57:13
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★ ★
merfect(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by merfect at 2014-05-14 16:57:13
还不太会用blast啊。用那个检验gapdh大鼠序列，e值都在0.05左右，可以吗？是不是还需要看别的结果啊？
...

你用cDNA样品，可能有基因组污染，引物最好在2个外显子的连接处，或者RNA样品除DNA。
为避免非特异性扩增，引物长度必须大于20 bp（对于GAPDH，这样做也难免出非特异性扩增）。
一个笨办法就是引物F、引物R分别在大鼠基因组库（如果需要的话）和转录本库中查找同源序列，记录能完全匹配的那些序列（所在染色体和碱基序号），最后综合引物F和引物R匹配的序列，看是否能扩增出片段，长度多少？
或者设计的引物直接检验，直到设计出合格的引物为止。因为GAPDH的同源序列太多，难免扩增出不同长度的片段。
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4楼2014-05-14 17:37:06
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merfect

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-14 17:37:06
你用cDNA样品，可能有基因组污染，引物最好在2个外显子的连接处，或者RNA样品除DNA。
为避免非特异性扩增，引物长度必须大于20 bp（对于GAPDH，这样做也难免出非特异性扩增）。
一个笨办法就是引物F、引物R分别在 ...

大概懂了你说的这些。多谢你的建议~我也在想会不会是有污染。很有可能是提取过程中出现的污染。试剂盒说是可以完全去除DNA和蛋白的，但是我觉得我处理样本的时候可能存在问题，导致污染的。请问一下，你处理过骨髓，用骨髓提取过RNA吗？
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5楼2014-05-14 21:33:05
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-15 21:03:21
不要老想着自己设计引物。内参引物从文献中找。
从大鼠细胞换到骨髓，你引物不测试就做？
我们都是在普通PCR下，条带单一才能上实时定量的，不然会被老师骂的。
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6楼2014-05-14 21:42:24
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by merfect at 2014-05-14 21:33:05
大概懂了你说的这些。多谢你的建议~我也在想会不会是有污染。很有可能是提取过程中出现的污染。试剂盒说是可以完全去除DNA和蛋白的，但是我觉得我处理样本的时候可能存在问题，导致污染的。请问一下，你处理过骨 ...

没处理过骨髓，但是标准过程是要用DNase I除DNA。
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7楼2014-05-15 08:49:34
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merfect

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-14 21:42:24
不要老想着自己设计引物。内参引物从文献中找。
从大鼠细胞换到骨髓，你引物不测试就做？
我们都是在普通PCR下，条带单一才能上实时定量的，不然会被老师骂的。

我们没老师管，自己做。。。呵呵。内参就是文献的，没自己设计。你的意思是怎么测试引物啊？blast吗？
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8楼2014-05-15 20:47:26
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merfect

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-15 08:49:34
没处理过骨髓，但是标准过程是要用DNase I除DNA。...

谢谢~
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9楼2014-05-15 20:50:38
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-15 21:03:30
很明显，引物特异性不好

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-05-15 21:02:44
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