应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？
51/1返回列表
查看: 6864  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

merfect

新虫 (初入文坛)

[求助] 内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？ 已有3人参与

本人菜鸟一枚。用荧光PCR。原来用的这个内参做大鼠细胞，按照50度2min预变性，95度15min变性，95度10s，60度32s退火，40循环然后熔解，做的都很好。现在换成骨髓，就做的很差。为什么啊？求分析。图在下面。
细胞的时候CT值23，扩增熔解都很好。
第一次，退火62度32s，CT值31，扩增很好，熔解不好。
第二次，用了三步法，条件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循环然后熔解，CT值28，扩增好，熔解不好，双峰。是引物二聚体吗？还是非特异性扩增呢？
第三次，改回两步法，改为原来的60度32s，CT值24，扩增好，熔解不好。还是双峰。
第四次，两步法，条件没变，我最开始以为是骨髓提RNA，逆转录过程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，结果还是这样。CT值24，扩增好，熔解还是双峰。
请问一下，这是什么原因呢？为什么GAPDH会做成这样呢？和引物有关系吗？我需要重新设计引物吗？原来用大鼠细胞的时候这个引物是可以的啊，现在换成骨髓就不能用了吗？或者，还需要改变什么条件才能变成单峰呢？

多谢多谢！

内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？
第一次扩增，62度32s，CT值31.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-1
第一次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-2
第二次扩增，三步法，CT值28.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-3
第二次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-4
第三次扩增，60度32s，CT值24.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-5
第三次熔解.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-6
第四次扩增，换了新的cDNA，CT值24.jpg


内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？-7
第四次熔解.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-13 21:04:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-15 21:03:30
很明显，引物特异性不好

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2014-05-15 21:02:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
GAPDH是多拷贝，在基因组里有很多高度同源的序列，你设计引物不BLAST检验吗？
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-14 08:49:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

merfect

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-05-14 08:49:00
GAPDH是多拷贝，在基因组里有很多高度同源的序列，你设计引物不BLAST检验吗？

还不太会用blast啊。用那个检验gapdh大鼠序列，e值都在0.05左右，可以吗？是不是还需要看别的结果啊？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-14 16:57:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★ ★
merfect(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by merfect at 2014-05-14 16:57:13
还不太会用blast啊。用那个检验gapdh大鼠序列，e值都在0.05左右，可以吗？是不是还需要看别的结果啊？
...

你用cDNA样品，可能有基因组污染，引物最好在2个外显子的连接处，或者RNA样品除DNA。
为避免非特异性扩增，引物长度必须大于20 bp（对于GAPDH，这样做也难免出非特异性扩增）。
一个笨办法就是引物F、引物R分别在大鼠基因组库（如果需要的话）和转录本库中查找同源序列，记录能完全匹配的那些序列（所在染色体和碱基序号），最后综合引物F和引物R匹配的序列，看是否能扩增出片段，长度多少？
或者设计的引物直接检验，直到设计出合格的引物为止。因为GAPDH的同源序列太多，难免扩增出不同长度的片段。
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-14 17:37:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:43 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:31 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +3 简单化xn 2026-08-22 7/350 2026-08-22 19:46 by 简单化xn
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 8/400 2026-08-22 18:29 by 淀粉搬运工
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭