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内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？ 已有3人参与
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本人菜鸟一枚。用荧光PCR。原来用的这个内参做大鼠细胞，按照50度2min预变性，95度15min变性，95度10s，60度32s退火，40循环然后熔解，做的都很好。现在换成骨髓，就做的很差。为什么啊？求分析。图在下面。 细胞的时候CT值23，扩增熔解都很好。 第一次，退火62度32s，CT值31，扩增很好，熔解不好。 第二次，用了三步法，条件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循环然后熔解，CT值28，扩增好，熔解不好，双峰。是引物二聚体吗？还是非特异性扩增呢？ 第三次，改回两步法，改为原来的60度32s，CT值24，扩增好，熔解不好。还是双峰。 第四次，两步法，条件没变，我最开始以为是骨髓提RNA，逆转录过程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，结果还是这样。CT值24，扩增好，熔解还是双峰。 请问一下，这是什么原因呢？为什么GAPDH会做成这样呢？和引物有关系吗？我需要重新设计引物吗？原来用大鼠细胞的时候这个引物是可以的啊，现在换成骨髓就不能用了吗？或者，还需要改变什么条件才能变成单峰呢？ 多谢多谢！   第一次扩增，62度32s，CT值31.jpg  第一次熔解.jpg  第二次扩增，三步法，CT值28.jpg  第二次熔解.jpg  第三次扩增，60度32s，CT值24.jpg  第三次熔解.jpg  第四次扩增，换了新的cDNA，CT值24.jpg  第四次熔解.jpg |
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我也在想会不会是有污染。很有可能是提取过程中出现的污染。试剂盒说是可以完全去除DNA和蛋白的，但是我觉得我处理样本的时候可能存在问题，导致污染的。请问一下，你处理过骨髓，用骨髓提取过RNA吗？ 
5楼2014-05-14 21:33:05
jurkat.1640
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2楼2014-05-14 08:49:00
3楼2014-05-14 16:57:13
jurkat.1640
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merfect(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
merfect(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
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你用cDNA样品，可能有基因组污染，引物最好在2个外显子的连接处，或者RNA样品除DNA。 为避免非特异性扩增，引物长度必须大于20 bp（对于GAPDH，这样做也难免出非特异性扩增）。 一个笨办法就是引物F、引物R分别在大鼠基因组库（如果需要的话）和转录本库中查找同源序列，记录能完全匹配的那些序列（所在染色体和碱基序号），最后综合引物F和引物R匹配的序列，看是否能扩增出片段，长度多少？ 或者设计的引物直接检验，直到设计出合格的引物为止。因为GAPDH的同源序列太多，难免扩增出不同长度的片段。 |
4楼2014-05-14 17:37:06
