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merfect

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2439696
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专业: 原发性肾脏疾病

[求助] 内参GAPDH跑PCR总是做不好，总是双峰，是怎么回事啊？已有3人参与

本人菜鸟一枚。用荧光PCR。原来用的这个内参做大鼠细胞，按照50度2min预变性，95度15min变性，95度10s，60度32s退火，40循环然后熔解，做的都很好。现在换成骨髓，就做的很差。为什么啊？求分析。图在下面。
细胞的时候CT值23，扩增熔解都很好。
第一次，退火62度32s，CT值31，扩增很好，熔解不好。
第二次，用了三步法，条件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循环然后熔解，CT值28，扩增好，熔解不好，双峰。是引物二聚体吗？还是非特异性扩增呢？
第三次，改回两步法，改为原来的60度32s，CT值24，扩增好，熔解不好。还是双峰。
第四次，两步法，条件没变，我最开始以为是骨髓提RNA，逆转录过程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，结果还是这样。CT值24，扩增好，熔解还是双峰。
请问一下，这是什么原因呢？为什么GAPDH会做成这样呢？和引物有关系吗？我需要重新设计引物吗？原来用大鼠细胞的时候这个引物是可以的啊，现在换成骨髓就不能用了吗？或者，还需要改变什么条件才能变成单峰呢？

多谢多谢！