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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达，现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10，测序正确后提取了质粒，下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了，每次做转化都不成功，板子上长满了克隆，可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题，我也分析了原因，1是感受态（我后来又用了同学的感受态，这批感受态他之前用过，没问题），2是板子的抗生素（我用这批板子做过其他实验，也没问题）3是质粒（我又把提出来的这个质粒送去了测序，也没问题）4实验操作（转化我做过很多次，而且这个转化实验我也重复了几次，每次都没阳性克隆）
        问题就是这么个问题，请各路大神帮我分析分析，我第一次做原核表达。（额～本来想发金币表示感谢的，可是我穷，就三十个-_-||，所以。。。）请各路大神不吝赐教，先谢谢啦

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xuejia174

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1楼 2015-07-25 11:05:30
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wuwuqaz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:40
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:25:54
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？
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2楼2015-07-25 11:12:21
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuwuqaz at 2015-07-25 11:12:21
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？

抗性应该没问题呀，我用这批板子同时做了一个三千多bp的另一个基因的转化就做出来了

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3楼2015-07-25 11:17:11
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great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:48
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:03
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进行鉴定，等长满了板子，板子的抗性可能丢失，产生其他杂菌的可能性也增加。

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4楼2015-07-25 12:19:49
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人车

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:55
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:28
没有阳性的是你通过菌落PCR扩增没有目的条带是吗？
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5楼2015-07-25 12:50:19
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人车 at 2015-07-25 12:50:19
没有阳性的是你通过菌落PCR扩增没有目的条带是吗？

是的，我先用天根的双组分的酶做了菌落检测，没有阳性克隆，然后觉得有可能这个酶不好所以没检测出，所以又用了B Taq再做了一次，还是没有::>_<::

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6楼2015-07-25 18:48:30
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by great07225388 at 2015-07-25 12:19:49
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进 ...

没有阳性是我用目的基因的特异性引物做了菌落pcr，凝胶电泳结果显示没有扩出了目的基因的。转化是在42摄氏度热机90秒。

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7楼2015-07-25 18:56:52
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勤奋的工人

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
O,你不是318的吧

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8楼2015-07-26 06:17:31
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动力泉

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:48
最可能的问题是板子不能用，建议换一批新的试试；第二提取的质粒不好，建议重提

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好好学习
9楼2015-07-26 06:25:11
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:28:06
这不是什么原核表达的问题，就是转化的问题，该分析的问题楼上都分析到了，建议从你构建好的大肠杆菌划单菌落抽质粒开始一步一步重新做
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
10楼2015-07-26 08:55:16
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