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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
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等待晨曦

金虫 (小有名气)
还有你所谓的没有阳性克隆是怎么确定的？是诱导不表达还是通过PCR没扩出条带？

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严于律己，宽以待人
21楼2015-07-28 18:16:11
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
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20楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-07-28 18:09:49
跟你说下我们实验室怎么做原核表达的:将你的目的基因与载体连接后转化DH5a或Top10,挑多个单菌落进行PCR鉴定（注意假阳性），对鉴定为疑似阳性的菌扩大培养然后提质粒进行双酶切鉴定，对鉴定阳性的质粒测序，正确后转 ...

嗯，那步骤差不多

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22楼2015-07-28 21:28:57
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-07-28 18:16:11
还有你所谓的没有阳性克隆是怎么确定的？是诱导不表达还是通过PCR没扩出条带？

pcr扩不出目的带

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23楼2015-07-28 21:30:08
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等待晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-28 21:30:08
pcr扩不出目的带
...

我们这边是没从BL21重组菌中扩增过，前面你都验证了质粒是阳性的转化21之后直接挑菌诱导表达就行

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严于律己，宽以待人
24楼2015-07-28 22:08:24
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-07-28 22:08:24
我们这边是没从BL21重组菌中扩增过，前面你都验证了质粒是阳性的转化21之后直接挑菌诱导表达就行
...

不检测，万一没转进去怎么办？

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25楼2015-07-29 00:03:02
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等待晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-29 00:03:02
不检测，万一没转进去怎么办？
...

你验证过的质粒转化BL21这就是阳转，这比连接产物转化效率高很多，板子上长出来的菌几乎百分之百是你的重组菌，

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严于律己，宽以待人
26楼2015-07-29 15:18:31
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tupokewang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-28 17:12:11
谢谢～我用的是菌落pcr，双酶切验证感觉好麻烦呀，不过听你们这么说，貌似很靠谱的样子。
...

菌落PCR有时候是不准确的，双酶切不麻烦，如果用慢酶，早上提完中午到下午之间就可以电泳了，如果是快酶，会更快。
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我相信我就是我，我相信明天。
27楼2015-07-29 16:42:48
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