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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达，现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10，测序正确后提取了质粒，下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了，每次做转化都不成功，板子上长满了克隆，可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题，我也分析了原因，1是感受态（我后来又用了同学的感受态，这批感受态他之前用过，没问题），2是板子的抗生素（我用这批板子做过其他实验，也没问题）3是质粒（我又把提出来的这个质粒送去了测序，也没问题）4实验操作（转化我做过很多次，而且这个转化实验我也重复了几次，每次都没阳性克隆）
        问题就是这么个问题，请各路大神帮我分析分析，我第一次做原核表达。（额～本来想发金币表示感谢的，可是我穷，就三十个-_-||，所以。。。）请各路大神不吝赐教，先谢谢啦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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xuejia174

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1楼 2015-07-25 11:05:30
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-07-28 18:09:49
跟你说下我们实验室怎么做原核表达的:将你的目的基因与载体连接后转化DH5a或Top10,挑多个单菌落进行PCR鉴定（注意假阳性），对鉴定为疑似阳性的菌扩大培养然后提质粒进行双酶切鉴定，对鉴定阳性的质粒测序，正确后转 ...

嗯，那步骤差不多

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22楼2015-07-28 21:28:57
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wuwuqaz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:40
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:25:54
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？
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2楼2015-07-25 11:12:21
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuwuqaz at 2015-07-25 11:12:21
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？

抗性应该没问题呀，我用这批板子同时做了一个三千多bp的另一个基因的转化就做出来了

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3楼2015-07-25 11:17:11
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great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:48
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:03
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进行鉴定，等长满了板子，板子的抗性可能丢失，产生其他杂菌的可能性也增加。

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4楼2015-07-25 12:19:49
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