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nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题,求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达,现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10,测序正确后提取了质粒,下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了,每次做转化都不成功,板子上长满了克隆,可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题,我也分析了原因,1是感受态(我后来又用了同学的感受态,这批感受态他之前用过,没问题),2是板子的抗生素(我用这批板子做过其他实验,也没问题)3是质粒(我又把提出来的这个质粒送去了测序,也没问题)4实验操作(转化我做过很多次,而且这个转化实验我也重复了几次,每次都没阳性克隆)
        问题就是这么个问题,请各路大神帮我分析分析,我第一次做原核表达。(额~本来想发金币表示感谢的,可是我穷,就三十个-_-||,所以。。。)请各路大神不吝赐教,先谢谢啦

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等待晨曦

金虫 (小有名气)

跟你说下我们实验室怎么做原核表达的:将你的目的基因与载体连接后转化DH5a或Top10,挑多个单菌落进行PCR鉴定(注意假阳性),对鉴定为疑似阳性的菌扩大培养然后提质粒进行双酶切鉴定,对鉴定阳性的质粒测序,正确后转化BL21,挑几个单菌落诱导表达。

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严于律己,宽以待人
20楼2015-07-28 18:09:49
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等待晨曦

金虫 (小有名气)

还有你所谓的没有阳性克隆是怎么确定的?是诱导不表达还是通过PCR没扩出条带?

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严于律己,宽以待人
21楼2015-07-28 18:16:11
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等待晨曦

金虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-28 21:30:08
pcr扩不出目的带
...

我们这边是没从BL21重组菌中扩增过,前面你都验证了质粒是阳性的转化21之后直接挑菌诱导表达就行

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严于律己,宽以待人
24楼2015-07-28 22:08:24
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等待晨曦

金虫 (小有名气)

引用回帖:
25楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-29 00:03:02
不检测,万一没转进去怎么办?
...

你验证过的质粒转化BL21这就是阳转,这比连接产物转化效率高很多,板子上长出来的菌几乎百分之百是你的重组菌,

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严于律己,宽以待人
26楼2015-07-29 15:18:31
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