应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
53/1返回列表
查看: 1996  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达，现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10，测序正确后提取了质粒，下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了，每次做转化都不成功，板子上长满了克隆，可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题，我也分析了原因，1是感受态（我后来又用了同学的感受态，这批感受态他之前用过，没问题），2是板子的抗生素（我用这批板子做过其他实验，也没问题）3是质粒（我又把提出来的这个质粒送去了测序，也没问题）4实验操作（转化我做过很多次，而且这个转化实验我也重复了几次，每次都没阳性克隆）
        问题就是这么个问题，请各路大神帮我分析分析，我第一次做原核表达。（额～本来想发金币表示感谢的，可是我穷，就三十个-_-||，所以。。。）请各路大神不吝赐教，先谢谢啦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xuejia174

» 猜你喜欢
1楼 2015-07-25 11:05:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 等待晨曦 at 2015-07-28 18:16:11
还有你所谓的没有阳性克隆是怎么确定的？是诱导不表达还是通过PCR没扩出条带？

pcr扩不出目的带

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
23楼2015-07-28 21:30:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答

wuwuqaz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:40
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:25:54
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？
赞一下 回复此楼
2楼2015-07-25 11:12:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuwuqaz at 2015-07-25 11:12:21
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？

抗性应该没问题呀，我用这批板子同时做了一个三千多bp的另一个基因的转化就做出来了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2015-07-25 11:17:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:48
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:03
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进行鉴定，等长满了板子，板子的抗性可能丢失，产生其他杂菌的可能性也增加。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2015-07-25 12:19:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 6/300 2026-08-25 00:11 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +7 scalable 2026-08-24 7/350 2026-08-24 23:01 by anata1209
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +7 图啦图啦 2026-08-24 8/400 2026-08-24 22:00 by maomao_da
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 3/150 2026-08-24 21:59 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 我面上完蛋了 +9 且听虎啸 2026-08-20 10/500 2026-08-24 20:08 by 苦寒来香
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭