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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:28:20
BL21生长速度比DH5a或top10快一些，建议你转化之后培养时间稍微短一点试试。
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nianmo0599
路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
11楼2015-07-26 10:08:04
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 勤奋的工人 at 2015-07-26 06:17:31
O,你不是318的吧

什么意思？不懂。还有，你起得真早～～

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12楼2015-07-26 10:29:16
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 游侠892 at 2015-07-26 10:08:04
BL21生长速度比DH5a或top10快一些，建议你转化之后培养时间稍微短一点试试。

好的，谢谢

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13楼2015-07-26 10:30:36
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 动力泉 at 2015-07-26 06:25:11
最可能的问题是板子不能用，建议换一批新的试试；第二提取的质粒不好，建议重提

谢谢

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14楼2015-07-26 20:23:50
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dehong1573 at 2015-07-26 08:55:16
这不是什么原核表达的问题，就是转化的问题，该分析的问题楼上都分析到了，建议从你构建好的大肠杆菌划单菌落抽质粒开始一步一步重新做

谢谢

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15楼2015-07-26 20:25:05
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tupokewang

铜虫 (小有名气)
你验证方法是什么，如果是用菌落PCR的话，有的时候是不准确的，建立提质粒双酶切验证。再就是你的抗生素时间会不会很长，培养时间建立不要太长，大肠生长周期短，按照上述方法，应该不会出现问题，建立重新做一批新的感受态，新鲜的感受态转化效率最高。
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我相信我就是我，我相信明天。
16楼2015-07-28 09:33:55
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xuejia174

禁虫 (小有名气)
送红花一朵
本帖内容被屏蔽
17楼2015-07-28 16:14:54
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by tupokewang at 2015-07-28 09:33:55
你验证方法是什么，如果是用菌落PCR的话，有的时候是不准确的，建立提质粒双酶切验证。再就是你的抗生素时间会不会很长，培养时间建立不要太长，大肠生长周期短，按照上述方法，应该不会出现问题，建立重新做一批新 ...

谢谢～我用的是菌落pcr，双酶切验证感觉好麻烦呀，不过听你们这么说，貌似很靠谱的样子。

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18楼2015-07-28 17:12:11
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by xuejia174 at 2015-07-28 16:14:54
重提质粒，注意质粒不要污染。新配板子，用新的抗生素再做。

谢谢，我今天做出来啦，至少菌落pcr跑胶是对的，谢谢各位啦

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19楼2015-07-28 17:22:00
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等待晨曦

金虫 (小有名气)
跟你说下我们实验室怎么做原核表达的:将你的目的基因与载体连接后转化DH5a或Top10,挑多个单菌落进行PCR鉴定（注意假阳性），对鉴定为疑似阳性的菌扩大培养然后提质粒进行双酶切鉴定，对鉴定阳性的质粒测序，正确后转化BL21，挑几个单菌落诱导表达。

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严于律己，宽以待人
20楼2015-07-28 18:09:49
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