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nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题,求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达,现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10,测序正确后提取了质粒,下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了,每次做转化都不成功,板子上长满了克隆,可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题,我也分析了原因,1是感受态(我后来又用了同学的感受态,这批感受态他之前用过,没问题),2是板子的抗生素(我用这批板子做过其他实验,也没问题)3是质粒(我又把提出来的这个质粒送去了测序,也没问题)4实验操作(转化我做过很多次,而且这个转化实验我也重复了几次,每次都没阳性克隆)
        问题就是这么个问题,请各路大神帮我分析分析,我第一次做原核表达。(额~本来想发金币表示感谢的,可是我穷,就三十个-_-||,所以。。。)请各路大神不吝赐教,先谢谢啦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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tupokewang

铜虫 (小有名气)

你验证方法是什么,如果是用菌落PCR的话,有的时候是不准确的,建立提质粒双酶切验证。再就是你的抗生素时间会不会很长,培养时间建立不要太长,大肠生长周期短,按照上述方法,应该不会出现问题,建立重新做一批新的感受态,新鲜的感受态转化效率最高。
我相信我就是我,我相信明天。
16楼2015-07-28 09:33:55
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tupokewang

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-07-28 17:12:11
谢谢~我用的是菌落pcr,双酶切验证感觉好麻烦呀,不过听你们这么说,貌似很靠谱的样子。
...

菌落PCR有时候是不准确的,双酶切不麻烦,如果用慢酶,早上提完中午到下午之间就可以电泳了,如果是快酶,会更快。
我相信我就是我,我相信明天。
27楼2015-07-29 16:42:48
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