应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1700  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达，现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10，测序正确后提取了质粒，下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了，每次做转化都不成功，板子上长满了克隆，可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题，我也分析了原因，1是感受态（我后来又用了同学的感受态，这批感受态他之前用过，没问题），2是板子的抗生素（我用这批板子做过其他实验，也没问题）3是质粒（我又把提出来的这个质粒送去了测序，也没问题）4实验操作（转化我做过很多次，而且这个转化实验我也重复了几次，每次都没阳性克隆）
        问题就是这么个问题，请各路大神帮我分析分析，我第一次做原核表达。（额～本来想发金币表示感谢的，可是我穷，就三十个-_-||，所以。。。）请各路大神不吝赐教，先谢谢啦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xuejia174

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-07-25 11:05:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by great07225388 at 2015-07-25 12:19:49
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进 ...

没有阳性是我用目的基因的特异性引物做了菌落pcr，凝胶电泳结果显示没有扩出了目的基因的。转化是在42摄氏度热机90秒。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-07-25 18:56:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答

wuwuqaz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:40
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:25:54
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？
赞一下 回复此楼
2楼2015-07-25 11:12:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuwuqaz at 2015-07-25 11:12:21
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？

抗性应该没问题呀，我用这批板子同时做了一个三千多bp的另一个基因的转化就做出来了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2015-07-25 11:17:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:48
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:03
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进行鉴定，等长满了板子，板子的抗性可能丢失，产生其他杂菌的可能性也增加。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2015-07-25 12:19:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿郑州大学，080500学硕，总分317分求调剂 +4 举个栗子oi 2026-03-24 5/250 2026-03-26 23:15 by 不吃魚的貓
[考研] 286求调剂 +3 lim0922 2026-03-26 3/150 2026-03-26 23:07 by 不吃魚的貓
[考研] 329求调剂 +6 钮恩雪 2026-03-25 6/300 2026-03-26 22:50 by fmesaito
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +3 nnnnnnn5 2026-03-25 3/150 2026-03-26 22:38 by 不吃魚的貓
[考研] 321求调剂 +6 wasdssaa 2026-03-26 6/300 2026-03-26 20:57 by sanrepian
[考研] 327求调剂 +7 prayer13 2026-03-23 7/350 2026-03-26 20:48 by 不吃魚的貓
[考研] 085600材料与化工306 +7 z1z2z3879 2026-03-21 7/350 2026-03-26 17:59 by fmesaito
[考研] 281求调剂 +6 Koxui 2026-03-24 7/350 2026-03-26 15:37 by 无际的草原
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 8/400 2026-03-25 20:34 by 热情沙漠
[考研] 0854电子信息求调剂 +7 α____ 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:37 by α____
[考研] 347求调剂 +4 L when 2026-03-25 4/200 2026-03-25 13:37 by cocolv
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 289材料与化工（085600）B区求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:20 by mx.yue
[考研] 生物学学硕求调剂 +7 小羊睡着了? 2026-03-23 10/500 2026-03-25 02:24 by 清风拂扬。 m
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考博] 26申博自荐 +3 whh869393 2026-03-24 3/150 2026-03-24 09:55 by 21018060
[考研] 求老师收我 +3 zzh16938784 2026-03-23 3/150 2026-03-23 12:56 by ztnimte
[考研] 308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-21 3/150 2026-03-22 16:54 by i_cooler
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 初试 317 +7 半拉月丙 2026-03-20 7/350 2026-03-21 22:26 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭