应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教
51/1返回列表
查看: 1943  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达方面的问题，求各路大神不吝赐教 已有7人参与

最近在做原核表达，现在已经将目的基因与   pet28a连接好并转入了top10，测序正确后提取了质粒，下一步准备将质粒转入bl21。
       问题就来了，每次做转化都不成功，板子上长满了克隆，可是挑12个没有一个是阳性的。::>_<::
     针对这个问题，我也分析了原因，1是感受态（我后来又用了同学的感受态，这批感受态他之前用过，没问题），2是板子的抗生素（我用这批板子做过其他实验，也没问题）3是质粒（我又把提出来的这个质粒送去了测序，也没问题）4实验操作（转化我做过很多次，而且这个转化实验我也重复了几次，每次都没阳性克隆）
        问题就是这么个问题，请各路大神帮我分析分析，我第一次做原核表达。（额～本来想发金币表示感谢的，可是我穷，就三十个-_-||，所以。。。）请各路大神不吝赐教，先谢谢啦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

xuejia174

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-07-25 11:05:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人车 at 2015-07-25 12:50:19
没有阳性的是你通过菌落PCR扩增没有目的条带是吗？

是的，我先用天根的双组分的酶做了菌落检测，没有阳性克隆，然后觉得有可能这个酶不好所以没检测出，所以又用了B Taq再做了一次，还是没有::>_<::

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-07-25 18:48:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答

wuwuqaz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:40
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:25:54
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？
赞一下 回复此楼
2楼2015-07-25 11:12:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nianmo0599

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuwuqaz at 2015-07-25 11:12:21
我想你的板子长满了克隆，但是一般来说转化率应该没有那么高。感觉是不是你的有抗性的板子放的太久了，要不再做一批抗性板子试试？

抗性应该没问题呀，我用这批板子同时做了一个三千多bp的另一个基因的转化就做出来了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2015-07-25 11:17:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

great07225388

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-25 19:58:48
nianmo0599: 金币+5 2015-07-26 20:27:03
那么问题来了，你挑了12个克隆都没有阳性，你所说的阳性是什么意思？菌落pcr没结果？测序不正确？你说长满了板子，抗性应该是存在的。转化方法？热激法？电转？建议转化之后培养时间不要太长，能看到菌落就挑克隆进行鉴定，等长满了板子，板子的抗性可能丢失，产生其他杂菌的可能性也增加。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2015-07-25 12:19:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 27 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +12 且听虎啸 2026-08-07 15/750 2026-08-09 13:11 by GZUZM
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +8 布布和一二 2026-08-08 15/750 2026-08-09 11:33 by 布布和一二
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 5/250 2026-08-08 21:54 by 13586093586
[基金申请] 好奇怪的filecode +3 布布和一二 2026-08-08 4/200 2026-08-08 17:46 by zhanghaozhu
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:22 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 5/250 2026-08-08 17:02 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:22 by oEVWOejN9taj
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:47 by oEVWOejN9taj
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:39 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:01 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 化学口download_prp&amp;fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭