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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » DNA电泳条带弥散
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

[求助] DNA电泳条带弥散 已有4人参与

大肠提质粒，酶切电泳，下面的低分子量条带总是弥散，什么情况。试过各种110v到80v电压，缓冲液也都换新配制的，试过延长和缩短酶切时间，小条带都弥散，什么情况，我的酶切体系50ul: 30ul 提取的DNA，5ul  10* FD Green buffer，超纯水13ul，Sal 1 和 Xba 1各1ul。

DNA电泳条带弥散
21045FFFD05577B353FF68E3FEFCCC27.jpg


DNA电泳条带弥散-1
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笑对人生，相信自己。
1楼 2015-06-23 15:12:16
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anubis.c1884

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有木有确定酶切位点的单一性啊，不是说小条带就能比较好地切下来的~万一是被消化了呢~
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2楼2015-06-23 15:24:58
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-23 22:03:44
你首先确定一下质粒的浓度，50ul 的体系切的质粒不大于5ug，其次，你还要确定酶切位点的单一性，最后，你要确定一下你的酶的效率如何，效率高的酶切出来的效果才好，效率低的酶切出来的效果不好，容易弥散，还有，你要确定你切下来的片段没有降解。
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123456
3楼2015-06-23 16:12:04
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你检测质粒的时候有没有下面那个带？是试剂盒提的质粒吗？质粒的质量怎么样？如果初始质粒里面没有那个弥散而且质量可以的话，建议减少模板的量到1ug，并做一个15min，30min 60min的切割时间梯度实验，如果下面的弥散随着时间依次加深加长的话就是酶的质量问题，和试剂公司交涉换酶吧~
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大家相互帮助哈
4楼2015-06-23 23:59:30
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 16:12:04
你首先确定一下质粒的浓度，50ul 的体系切的质粒不大于5ug，其次，你还要确定酶切位点的单一性，最后，你要确定一下你的酶的效率如何，效率高的酶切出来的效果才好，效率低的酶切出来的效果不好，容易弥散，还有，你 ...

质粒浓度0.106ug/ul，50ul体系酶切上30ul，应该没问题，260/280的值为1.96偏高，会不会是RNA干扰造成的弥散
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笑对人生，相信自己。
5楼2015-06-25 08:21:48
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板纯度低（质量）
酶用量多
dNTP,镁离子用量多
看你的marker，胶的质量也要改进。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-06-25 09:29:37
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