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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

[求助] DNA电泳条带弥散 已有4人参与

大肠提质粒,酶切电泳,下面的低分子量条带总是弥散,什么情况。试过各种110v到80v电压,缓冲液也都换新配制的,试过延长和缩短酶切时间,小条带都弥散,什么情况,我的酶切体系50ul: 30ul 提取的DNA,5ul  10* FD Green buffer,超纯水13ul,Sal 1 和 Xba 1各1ul。

DNA电泳条带弥散
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DNA电泳条带弥散-1
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笑对人生,相信自己。
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anubis.c1884

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有木有确定酶切位点的单一性啊,不是说小条带就能比较好地切下来的~万一是被消化了呢~
2楼2015-06-23 15:24:58
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-23 22:03:44
你首先确定一下质粒的浓度,50ul 的体系切的质粒不大于5ug,其次,你还要确定酶切位点的单一性,最后,你要确定一下你的酶的效率如何,效率高的酶切出来的效果才好,效率低的酶切出来的效果不好,容易弥散,还有,你要确定你切下来的片段没有降解。
123456
3楼2015-06-23 16:12:04
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你检测质粒的时候有没有下面那个带?是试剂盒提的质粒吗?质粒的质量怎么样?如果初始质粒里面没有那个弥散而且质量可以的话,建议减少模板的量到1ug,并做一个15min,30min 60min的切割时间梯度实验,如果下面的弥散随着时间依次加深加长的话就是酶的质量问题,和试剂公司交涉换酶吧~
大家相互帮助哈
4楼2015-06-23 23:59:30
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

引用回帖:
3楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 16:12:04
你首先确定一下质粒的浓度,50ul 的体系切的质粒不大于5ug,其次,你还要确定酶切位点的单一性,最后,你要确定一下你的酶的效率如何,效率高的酶切出来的效果才好,效率低的酶切出来的效果不好,容易弥散,还有,你 ...

质粒浓度0.106ug/ul,50ul体系酶切上30ul,应该没问题,260/280的值为1.96偏高,会不会是RNA干扰造成的弥散
笑对人生,相信自己。
5楼2015-06-25 08:21:48
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模板纯度低(质量)
酶用量多
dNTP,镁离子用量多
看你的marker,胶的质量也要改进。。。
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-06-25 09:29:37
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