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分子新手，PCR产物回收浓度太低，请教各位虫友！ 已有6人参与
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| 本人刚开始接触分子方面的试验，准备做RNA干扰，目前正用带T7的引物跑PCR，产物带挺亮，然后用天根的试剂盒切胶回收的浓度太低，一般都在30ng/μl左右。我后续要用这个回收产物做模板走promega T7BiboMAX Express RNAi System 这个试剂盒的程序，要求模板量在1 μg，但我的回收产物远不够这个量，请教各位虫友怎么提高回收产物的量，或者有做过这个的我想请教下整个过程，非常感谢！ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:41:45
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我之前做过RNAi实验，刚开始也和你一样，DNA模板浓度低上不去，没法合成RNA，后来试了很多种方法，给你介绍一下： 1、如上面虫友所说，多做几个PCR重复，我50uL反应体系做了5个重复，最后会收到一起，20uL水依次洗脱5个柱子，最后浓度能达到200到300之间； 2、也是多做几次PCR重复，最后将所有PCR产物混合在一起，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积醋酸钠，充分混匀后放在-20℃冰箱半个小时以上，之后以离心机最大转速（12000rpm以上）离心15min，再用75%乙醇洗涤，同样采用最大转速离心，最后加20uL水溶解即可，取其中1uL电泳检测。此法回收产物可能含有杂质，但只要没有非特异性扩增而且引物二聚体较少即可，此法回收效率比试剂盒高很多，可以一试 |
8楼2015-06-19 20:37:43
博克侬浮码
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2楼2015-06-18 10:36:19
3楼2015-06-18 11:03:24
4楼2015-06-18 15:54:09
