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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)

[交流] PCR产物再进行PCR

大家有木有做过PCR回收产物为模板扩增目的基因啊？我听说是可行的，可我们老师说不稳定，很不稳定，大家给个意见吧，谢谢
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1楼 2012-04-12 14:47:14
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-12 17:54:23
西瓜: 回帖置顶 2012-04-12 23:45:25
有一个问题你没说清楚：PCR产物回收后做模板再次进行PCR，那么这个第二轮 PCR的引物是另一套，还是相同的引物？
如果是另一套，比如内测引物，这种nested-PCR没问题，并且常常使用；
而如果是相同引物，的确不稳定：
产物做模板的浓度需要摸索；由于Taq酶的不保真引起的产物轻微差别也会有不利影响等等；所以说，可以考虑将回收产物转化并筛菌，拿菌液做模板，就很容易了
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6楼2012-04-12 16:03:57
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普通回帖

ycttfeng

木虫 (小有名气)
★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
可行啊
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2楼2012-04-12 14:54:59
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
可行
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3楼2012-04-12 15:22:32
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风之语007

金虫 (小有名气)
★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
可行的
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4楼2012-04-12 15:50:41
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-04-12 23:45:14
如果第一轮PCR产物量很低的话可以用来作为下一轮PCR的模板。
巢氏PCR都是经过两轮扩增的。

用高保值度的酶和较高的退火温度是可以基本保证产物的特异性的。
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5楼2012-04-12 16:01:08
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)
西瓜: , 绝对可行！ 2012-04-12 23:45:48
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-04-12 16:03:57:
有一个问题你没说清楚：PCR产物回收后做模板再次进行PCR，那么这个第二轮 PCR的引物是另一套，还是相同的引物？
如果是另一套，比如内测引物，这种nested-PCR没问题，并且常常使用；
而如果是相同引物，的确不稳 ...

不是相同的引物，是想从得到的基因片段上再扩增出一部分片段，这样是可行的吧？我现在也做了转化了，以后就用菌液当模板了
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7楼2012-04-12 16:18:15
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dfl204 at 2012-04-12 16:01:08:
如果第一轮PCR产物量很低的话可以用来作为下一轮PCR的模板。
巢氏PCR都是经过两轮扩增的。

用高保值度的酶和较高的退火温度是可以基本保证产物的特异性的。

那我是不是需要提高退火温度啊？
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8楼2012-04-12 16:20:25
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可帅儿

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没试过，不过可以尝试一下
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9楼2012-04-12 18:29:04
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ouyangtao0102

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-04-12 23:46:04
非常同意虫友“gaoyang636”所说的。不同引物的话基本没问题，可以扩增出来，如果第二轮PCR用的是同一对引物的话有的时候可以扩出来，但有的时候是一片涂抹带。如果第二轮用的不是同一对引物，不需要特意去提高退火温度，按照你的这对引物的退火温度去扩增就是了。
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10楼2012-04-12 21:53:27
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julietguo

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近也在做nested-PCR，效果挺好的。不过如果可以的话，还是设计一对特异性高一点的引物，这样省得要做两次PCR。
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11楼2012-04-13 08:15:29
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qqm8445

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以呀，我经常这样做，没有问题，说有摸带的，是因为模板量太高了，可能要稀释PCR产物100倍，甚至200倍后再做，效果就很好了。
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12楼2012-04-13 08:31:44
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做过，用的不同的引物，从两端开始P，可以的
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13楼2012-04-13 08:54:29
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chenglong_li

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-04-12 16:03:57:
有一个问题你没说清楚：PCR产物回收后做模板再次进行PCR，那么这个第二轮 PCR的引物是另一套，还是相同的引物？
如果是另一套，比如内测引物，这种nested-PCR没问题，并且常常使用；
而如果是相同引物，的确不稳 ...

有道理！
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14楼2012-04-13 13:16:07
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youngker918

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以啊，把PCR产物稀释100倍，取稀释后的液体一微升作为模板加入新的PCR体系里就可以了
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15楼2012-04-13 18:59:35
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我爱沈泉

金虫 (小有名气)
可以咯。。
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16楼2012-04-13 21:53:12
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主 我现在也是在用第一轮的PCR产物作为第二轮PCR的模板，引物不同，我感觉结果也是不太稳定，刚得到的PCR产物做模板做二轮PCR的结果很好，但之后重复做就感觉不好了，很纠结呢？楼主是怎么做的呀  我打算将第一轮PCR产物连接到细胞中，提取质粒，然后做模板，进行二轮PCR  楼主支个招吧
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17楼2014-04-15 09:02:41
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-04-15 09:02:41
楼主 我现在也是在用第一轮的PCR产物作为第二轮PCR的模板，引物不同，我感觉结果也是不太稳定，刚得到的PCR产物做模板做二轮PCR的结果很好，但之后重复做就感觉不好了，很纠结呢？楼主是怎么做的呀  我打算将第一轮 ...

你第一轮做完后电泳检测了吗？还是直接进行第二轮PCR？
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18楼2014-04-18 17:56:39
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 艰苦温度 at 2014-04-18 17:56:39
你第一轮做完后电泳检测了吗？还是直接进行第二轮PCR？...

检测了 条带很亮 而且纯化后再进行的第二轮 第二轮有时候除了第二次的目的条带之外 做模板的那条带也会纯在
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19楼2014-04-19 10:20:36
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sobarrygar

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问你pcr的产物是什么？ssr还是aflp的呀，ssr感觉不行吧
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20楼2015-01-09 09:01:11
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