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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)

[交流] PCR产物再进行PCR

大家有木有做过PCR回收产物为模板扩增目的基因啊？我听说是可行的，可我们老师说不稳定，很不稳定，大家给个意见吧，谢谢
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1楼 2012-04-12 14:47:14
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-12 17:54:23
西瓜: 回帖置顶 2012-04-12 23:45:25
有一个问题你没说清楚：PCR产物回收后做模板再次进行PCR，那么这个第二轮 PCR的引物是另一套，还是相同的引物？
如果是另一套，比如内测引物，这种nested-PCR没问题，并且常常使用；
而如果是相同引物，的确不稳定：
产物做模板的浓度需要摸索；由于Taq酶的不保真引起的产物轻微差别也会有不利影响等等；所以说，可以考虑将回收产物转化并筛菌，拿菌液做模板，就很容易了
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6楼2012-04-12 16:03:57
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
晓婧happy(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-04-12 23:45:14
如果第一轮PCR产物量很低的话可以用来作为下一轮PCR的模板。
巢氏PCR都是经过两轮扩增的。

用高保值度的酶和较高的退火温度是可以基本保证产物的特异性的。
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5楼2012-04-12 16:01:08
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)
西瓜: , 绝对可行！ 2012-04-12 23:45:48
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-04-12 16:03:57:
有一个问题你没说清楚：PCR产物回收后做模板再次进行PCR，那么这个第二轮 PCR的引物是另一套，还是相同的引物？
如果是另一套，比如内测引物，这种nested-PCR没问题，并且常常使用；
而如果是相同引物，的确不稳 ...

不是相同的引物，是想从得到的基因片段上再扩增出一部分片段，这样是可行的吧？我现在也做了转化了，以后就用菌液当模板了
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7楼2012-04-12 16:18:15
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晓婧happy

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dfl204 at 2012-04-12 16:01:08:
如果第一轮PCR产物量很低的话可以用来作为下一轮PCR的模板。
巢氏PCR都是经过两轮扩增的。

用高保值度的酶和较高的退火温度是可以基本保证产物的特异性的。

那我是不是需要提高退火温度啊？
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8楼2012-04-12 16:20:25
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