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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 问一个关于荧光实时定量PCR的问题
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rabbitzumi

铜虫 (小有名气)

[交流] 问一个关于荧光实时定量PCR的问题已有2人参与

最近在线设计了一对引物，合成回来做了个预实验，大鼠的TNFa, 反应体系如下：
2* UltraSYBR Mix : 12.5 uL
Forward primer: 0.5 uL(Final concentration: 200 nM)
Reverse primer: 0.5 uL(Final concentration: 200 nM)
Template DNA: 1 uL
RNase free water: 10.5 uL

总反应体系为 25 uL.

上下游引物的退火温度分别为：48.7 和46.6 度。
反应条件也基本按照试剂盒说明:
预变性  95度   10min
变性    95度   15 s
退火/延伸  48度  1 min
变性和退火/延伸 共计循环 40次
溶解曲线分析：参照仪器默认设定
下面是我的实验结果：
我的问题是：扩增曲线怎么会是负值？

问一个关于荧光实时定量PCR的问题
realtime PCR.png
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青春无限宝贵，学海无涯驰骋
1楼2015-06-17 18:51:14
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王彬2014

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
起峰太早，建议你相同倍比稀释做一下，大约需要稀释到1000，保证CT值为18-30，稀释到相同浓度，再做，有单峰不错，引物没问题
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回顾回想回眸
2楼2015-06-18 08:22:25
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易水秋寒

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
模板量太大了，梯度稀释后再试试吧
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3楼2015-06-18 10:43:12
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rabbitzumi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王彬2014 at 2015-06-18 08:22:25
起峰太早，建议你相同倍比稀释做一下，大约需要稀释到1000，保证CT值为18-30，稀释到相同浓度，再做，有单峰不错，引物没问题

谢谢你的建议。事实上我摸条件时，做了模板1-1/100的稀释梯度，我提供的图片是cDNA模板稀释100倍的结果，看来我应该继续向下稀释试一下。
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青春无限宝贵，学海无涯驰骋
4楼2015-06-24 19:40:14
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rabbitzumi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 易水秋寒 at 2015-06-18 10:43:12
模板量太大了，梯度稀释后再试试吧

谢谢您的回复，我稀释一下模板试试看。
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青春无限宝贵，学海无涯驰骋
5楼2015-06-24 19:40:56
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