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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 多态性条带不清楚的原因
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angelababy91

新虫 (初入文坛)

[求助] 多态性条带不清楚的原因 已有3人参与

我提取的菌丝DNA浓度为30ng/ml，纯度OD260/280在1.9左右，跑DNA多态性的PCR后凝胶成像电泳图条带中有拖尾现象，琼脂糖胶的浓度为2.5%，电泳电压100V50分钟。PCR的反应体系为：94℃条件下预变性5min，94℃变性1min，52℃退火50S，72℃复性2min，40次循环，最后72℃延伸8min，4℃条件下停止反应。拜托各位帮我找找电泳图条带拖尾的原因以及为什么会出现几个条带重叠的现象。谢谢啦~

多态性条带不清楚的原因
IMG_0382.JPG


多态性条带不清楚的原因-1
IMG_0383.JPG
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1楼 2015-06-15 20:25:50
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
angelababy91(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:42:07
给你寄点建议：
1、DNA浓度你确定是30 ng/mL而不是30 ng/uL，如果是前者，那么浓度就太低了吧。
2、PCR反应条件不太好，你的是“94℃变性1min，52℃退火50S，72℃复性2min，40次循环”，建议使用“94℃变性20s，52℃退火20S，72℃延伸25s，36次循环”，理由如下：PCR筛选多态性标记的产物一般很小（100bp到500bp之间），所以延伸时间不宜太长，而且变性和退火时间也不宜太长，你的都太长了，然后多态性标记差别很微小，所以产物浓度不宜太多，循环次数不宜太多，电泳的时候上样量也要控制。
3、电泳的时候如果胶浓度低分不开，可以提高胶浓度，还不行可以使用PAGE胶，实在不行用HRM也可以的。
4、看你的电泳图非特异性扩增多，一方面与你的变性退火及延伸时间长有关，还有一方面是你的引物退火温度低有关。
5、反应体系你没写出来，引物和模板浓度不宜过高，引物终浓度在0.5-1uM为宜，模板终浓度在1-5ng/uL为宜。



就这些了
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没有做不到，只有想不到！
5楼2015-06-19 20:22:50
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mangool

新虫 (初入文坛)
可能是染色液过于灵敏
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2楼2015-06-16 20:36:50
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freud1981213

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
angelababy91(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:41:56
如果你的提取菌丝DNA存在多态性，有条带重叠是因为琼脂糖凝胶无法分辨这个大小的片段。建议用PAGE电泳，分辨率会更高。
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agoodstartingpoint
3楼2015-06-16 21:50:03
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wangrui2015

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有可能退火温度有点低，建议做一下退火温度梯度试验
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4楼2015-06-19 16:29:48
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