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请问在做原核表达-蛋白纯化时用到的裂解液是购买的还是自己配制的？ 已有1人参与
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请问在做原核表达-蛋白纯化时用到的裂解液是购买的还是自己配制的？ 如果购买的商品化裂解液，是否还继续用超声裂解？ |
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恶魔的左眼
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【答案】应助回帖
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可以购买也可以自己配，我们就是自己配的，这样比较好掌握一些。 细胞裂解液的成分包括了Tris-HCl、EDTA 和NaCl。组织裂解液的成分主要是 Urea、thiourea、CHAPS 等。除了表达蛋白的提取裂解液外，上述两种裂解液在一些实验中的用途也不可小觑。本文介绍这两种裂解液的配方和配制过程。 组织裂解液配方： 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 100mM DTT 0.1543 g 4% CHAPS 0.4 g 0.5mM EDTA 0.00146 g 40Mm Tris 0.0485 g 2%(v/v) NP-40 0.2 ml 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml 5mM PMSF用前加 0.00871 g 2%pharmalyte 0.2ml 共10ml分装成400μl/每管(可应用于30-80毫克组织裂解) 细胞裂解液配方： 6M Urea(60. 06) 1.8018 g 2M thiourea(76.12) 0. 7613 g 65mM DTT 0.050 g 4% CHAPS 0.2 g 40Mm Trisbase 0.02425 g 共5ml分装成200μl/每管(可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解) 1、溶液准备 2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴酚蓝 , 2% DTT PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.4) , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧胆酸钠 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin ) 裂解液缓冲液：10mM Tris-HCl(pH7.4) , 0.15M NaCl , 5mM EDTA(pH8.0) , 1%Triton×100;使用前加5mM DTT,0.1mM PMSF异丙醇和5mM ε-氨基己酸 2、裂解液的制备 制备细胞裂解液： 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。 用100μl RIPA缓冲液冰浴溶解沉淀10min(每500000个细胞20μl RIPA缓冲液)。 10000rpm，4℃离心10min，取上清转移至新管。 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃储存。 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。 短时离心后点样电泳检测。 制备组织裂解液： 在制备过程中一直将溶胞液或组织放在冰上。 切开组织，称取组织1.5g于PBS中清洗。 在RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足5ml RIPA缓冲液，研磨20min。 将研磨液转移到1.5ml的离心管中，14000rpm，4℃离心10min。 取上清液作为完整的组织裂解液。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃储存。 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。 短时离心后点样电泳检测。 需要注意的是，为了减少以及杜绝核酸降解，样品被彻底匀浆之前的步骤需要多加留意。还有就是短时离心后点样电泳检测。让样品从脱离原来的生存环境的时间尽量缩短。 |
2楼2015-06-04 10:33:57
