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PCR目的条带暗，引物二聚体明亮，如何优化？ 已有10人参与
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各位老师，我最近提取RNA反转录后扩增一个基因，但是目的条带非常暗，相反引物二聚体非常明亮，引物合成报告单上2者的TM=64度左右，我做了一个56-65度的温度梯度PCR，56和57度都有非常暗的条带，其他温度就没有了，同时引物二聚体非常非常的量，我应该怎么优化呢？退火温度一般是TM-5度，我是否需要继续降低退火温度呢？ RNA降解严重会有什么后果呢？降解的RNA反转录后作为模板，是不是可能得不到我想要的模板，也就无法扩增目的片段了？谢谢各位~ |
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18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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| 虽然没有图，但是也明白你的意思了，如果说完全没有条带的话，就考虑模板降解 重新设计引物，选择有条带，很暗，模板是有的，引物的合理性需要验证，此外摸索退火温度，可以采用降落PCR，如果退火温度摸索不行，提高PCR扩增的特异性很多，使用特异性高的酶热启动酶扩增，能够一直引物二聚体，总体来说，从引物 试剂特异性两方面先考考吧 |
5楼2015-05-26 13:59:04
2楼2015-05-25 16:45:55
3楼2015-05-25 19:48:59
6楼2015-05-26 17:25:10