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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR目的条带暗，引物二聚体明亮，如何优化？
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Cindycclove

新虫 (小有名气)

[交流] PCR目的条带暗，引物二聚体明亮，如何优化？ 已有10人参与

各位老师，我最近提取RNA反转录后扩增一个基因，但是目的条带非常暗，相反引物二聚体非常明亮，引物合成报告单上2者的TM=64度左右，我做了一个56-65度的温度梯度PCR，56和57度都有非常暗的条带，其他温度就没有了，同时引物二聚体非常非常的量，我应该怎么优化呢？退火温度一般是TM-5度，我是否需要继续降低退火温度呢？
RNA降解严重会有什么后果呢？降解的RNA反转录后作为模板，是不是可能得不到我想要的模板，也就无法扩增目的片段了？谢谢各位~
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1楼 2015-05-25 16:43:00
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
反转录的时候用下游引物，会不会特异性好一点？那么下游引物的量如何加呢。Oligo dT 和 random 6mers 的浓度分别是50和100um，用特异性下游引物反转录，跟2者谁的浓度一致呢，只加下游引物还是配合Oligo dt random 6mers一起加呢？
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2楼2015-05-25 16:45:55
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erland21411

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-05-25 22:54:57
低温有特别暗的条带，个人觉得是非特异的扩增。
二聚体非常亮只是说明上下游引物之间容易结合，你目的条带没有可以考虑是模板的问题。
一般都不推荐用降解的RNA做模板，这样翻转录出来的cDNA更少更不稳定。
至于反转录的时候用下游引物这种做法，我没做过也没听说过，所以不清楚。
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3楼2015-05-25 19:48:59
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
换引物吧~~~~
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努力打败一切
4楼2015-05-26 12:50:48
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
虽然没有图，但是也明白你的意思了，如果说完全没有条带的话，就考虑模板降解 重新设计引物，选择有条带，很暗，模板是有的，引物的合理性需要验证，此外摸索退火温度，可以采用降落PCR，如果退火温度摸索不行，提高PCR扩增的特异性很多，使用特异性高的酶热启动酶扩增，能够一直引物二聚体，总体来说，从引物 试剂特异性两方面先考考吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-05-26 13:59:04
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-26 13:59:04
虽然没有图，但是也明白你的意思了，如果说完全没有条带的话，就考虑模板降解 重新设计引物，选择有条带，很暗，模板是有的，引物的合理性需要验证，此外摸索退火温度，可以采用降落PCR，如果退火温度摸索不行，提高 ...

最近在思考一个问题，理论上一次提出的RNA，我分次反转录的话，cDNA应该是一样的，但是我用同一个RNA，不同时间反转录出来的东西进行pcr结果不稳定，第一次反转录以后做了温度梯度，在57度有很暗的条带和引物二聚体（TM=64)，第二次反转录做了模板浓度梯度，采用的是57度退火，也有模板条带，但是有了很多非特异性扩增，考虑是温度太低所以导致的。而且今天觉得温度梯度时候出现的带，可能不是我的目的条带，那么我应该如何重新做温度梯度呢？采用57度时候最佳的模板浓度，做一个梯度PCR如何？
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6楼2015-05-26 17:25:10
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yangjingjing at 2015-05-26 12:50:48
换引物吧~~~~

我的模板比较奇怪，有3,9个高重复序列，所以引物很难设计，很容易就有错配，所以应该不能换引物了，我倒是觉得RNA降解得很厉害是一个原因，但是又没办法再优化，因为不是新鲜组织，而是储存液保存的虫卵。
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7楼2015-05-26 17:29:52
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等价交换fafu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-26 17:29:52
我的模板比较奇怪，有3,9个高重复序列，所以引物很难设计，很容易就有错配，所以应该不能换引物了，我倒是觉得RNA降解得很厉害是一个原因，但是又没办法再优化，因为不是新鲜组织，而是储存液保存的虫卵。...

+DMSO
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8楼2015-05-26 20:40:09
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随心小小莫

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做PCR一定不要把自己的思路给固定死了，除了温度还有很多其他的很多原因，引物，离子浓度，酶，PCR程序（PS：当然，程序影响小，一般不考虑）。你这种情况你先向下在将温度降低一点做看看情况（因为56、57是你做的最低温度），并且在现在这种赛选条件情况下每次都要做阴性和阳性对照。二聚物比较明显，目标条带暗，看看有没有除目标条带还有没有其他的条带，这样的情况一般会降低离子浓度，加强特异性：并且增加循环次数（PS：我最多只做到37,后面我就不好说有没有效果了）。
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9楼2015-05-26 21:39:01
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-26 17:25:10
最近在思考一个问题，理论上一次提出的RNA，我分次反转录的话，cDNA应该是一样的，但是我用同一个RNA，不同时间反转录出来的东西进行pcr结果不稳定，第一次反转录以后做了温度梯度，在57度有很暗的条带和引物二聚体 ...

首先，你的模板有问题吧，不同时间反转录结果不稳定，既然做了温度梯度和模板浓度梯度，照理说，应该能确定最佳温度和模板浓度吧，如果确定不了，说明就不是温度和模板浓度的原因，引物本身的合理性就存在问题，扩增有点二聚体和非特异性条带是正常的，除非用高特异性的试剂盒扩增，今天做温度梯度出现了条带，但是你都不能确定是否是目的条带.......温度和模板浓度，这两者是肯定要摸索的，如果摸索不出来，说明问题不在这儿，你问我57度做一个梯度PCR如何？做实验重在摸索，你不尝试怎么会知道结果呢
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-05-27 09:48:33
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