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tinychan

新虫 (初入文坛)

[求助] 同源克隆、简并引物、RACE 已有1人参与

最近在做同源克隆,下载了同源基因的CDS,通过核苷酸比对设计了简并引物,在基因组DNA上扩增得到预期片段,测序、比对结果显示为目的片段。
疑问一:cDNA进行扩增,同一对引物得到片段比基因组短了100多bp,心想可能有内含子吧,结果测序结果显示根本就不是目的基因。这是为什么呢?
疑问二:在基因组得到的核心片段上设计了RACE的基因特异性引物,通过RACE的两轮PCR得到5‘-RACE产物测序,结果在序列上找不到我的特异性引物,序列无法与核心片段拼接,NCBI上比对发现这又是另外一个基因。心塞了,为什么会这样子呢?
求大神指导指导!
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
(1)同源克隆应该根据氨基酸序列比对,利用密码子3位的摇摆碱基的特点,根据几个物种的保守型区域设计简并引物。
(2)你设计的引物可能特异性不够,或者PCR的条件需要优化,提高退火温度等
2楼2015-05-16 13:30:53
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