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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 同源克隆、简并引物、RACE
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tinychan

新虫 (初入文坛)

[求助] 同源克隆、简并引物、RACE 已有1人参与

最近在做同源克隆，下载了同源基因的CDS，通过核苷酸比对设计了简并引物，在基因组DNA上扩增得到预期片段，测序、比对结果显示为目的片段。
疑问一：cDNA进行扩增，同一对引物得到片段比基因组短了100多bp,心想可能有内含子吧，结果测序结果显示根本就不是目的基因。这是为什么呢？
疑问二：在基因组得到的核心片段上设计了RACE的基因特异性引物，通过RACE的两轮PCR得到5‘-RACE产物测序，结果在序列上找不到我的特异性引物，序列无法与核心片段拼接，NCBI上比对发现这又是另外一个基因。心塞了，为什么会这样子呢？
求大神指导指导！
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1楼 2015-05-16 10:41:47
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
(1)同源克隆应该根据氨基酸序列比对，利用密码子3位的摇摆碱基的特点，根据几个物种的保守型区域设计简并引物。
（2）你设计的引物可能特异性不够，或者PCR的条件需要优化，提高退火温度等
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2楼2015-05-16 13:30:53
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