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关于引物设计的问题 已有5人参与
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纯小白被分子实验老师要求自己设计引物， 但是我们加上酶切位点和保护碱基之后Tm有70多度，这个引物还需不需要改啊？ F: 5’ cgg gat ccc ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI R: 5’ cgg aat tcc gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI |
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cry_2013
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7楼2015-05-16 10:47:23
【答案】应助回帖
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demiiiii: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答很全面，对我这个小白来说很有帮助 2015-05-17 16:00:03
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总体来说感觉很不错啊，但是 1，引物当中应该是不小心复制了两次酶切位点和保护碱基吧？猜测你设计的引物是下面的序列： F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI R: 5’ c gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI 2， F引物的二级结构可能有点复杂。可以修改保护碱基成cgc。 cgc gg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 也可以根据目的片断的序列修改保护碱基。对于这两个酶，一般两到三个碱基都可以，三个更好。 3，两个引物的退火温度差别不大，这个很好。因为加了保护碱基和酶切位点，所以退火温度比较高。但是第一次PCR的时候只有后面的序列可以退火，温度在65-67，所以应该没问题的。有没有杂带只能做了PCR才能知道。 4，再比对下序列。 |
2楼2015-05-15 19:33:48
3楼2015-05-15 20:55:06
小蚂蚁虫
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4楼2015-05-15 22:59:21
