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demiiiii

新虫 (初入文坛)

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[求助] 关于引物设计的问题已有5人参与

纯小白被分子实验老师要求自己设计引物，但是我们加上酶切位点和保护碱基之后Tm有70多度，这个引物还需不需要改啊？

F: 5’ cgg gat ccc ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI
R: 5’ cgg aat tcc gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI

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1楼 2015-05-15 17:25:06

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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huachijin

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
demiiiii: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答很全面，对我这个小白来说很有帮助 2015-05-17 16:00:03

总体来说感觉很不错啊，但是
1，引物当中应该是不小心复制了两次酶切位点和保护碱基吧？猜测你设计的引物是下面的序列：
F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI
R: 5’ c gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI
2， F引物的二级结构可能有点复杂。可以修改保护碱基成cgc。
cgc gg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac
也可以根据目的片断的序列修改保护碱基。对于这两个酶，一般两到三个碱基都可以，三个更好。
3，两个引物的退火温度差别不大，这个很好。因为加了保护碱基和酶切位点，所以退火温度比较高。但是第一次PCR的时候只有后面的序列可以退火，温度在65-67，所以应该没问题的。有没有杂带只能做了PCR才能知道。
4，再比对下序列。

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2楼2015-05-15 19:33:48

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zhangyunjing

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

退火温度不需要考虑加入的酶切位点序列和保护碱基序列，只需要计算能与模板结合的引物序列的Tm就可以了

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rainwater

6楼2015-05-16 10:05:28

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demiiiii

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引用回帖:

2楼: Originally posted by huachijin at 2015-05-15 19:33:48
总体来说感觉很不错啊，但是
1，引物当中应该是不小心复制了两次酶切位点和保护碱基吧？猜测你设计的引物是下面的序列：
F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI
R: 5’ c gga att cct tgt ...

谢谢你的回答，对我们来说很有帮助，我想再请问一下，R引物的保护碱基是不是能改成CCT

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3楼2015-05-15 20:55:06

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