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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于引物设计的问题
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demiiiii

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于引物设计的问题 已有5人参与

纯小白被分子实验老师要求自己设计引物， 但是我们加上酶切位点和保护碱基之后Tm有70多度，这个引物还需不需要改啊？

F: 5’ cgg gat ccc ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’    BamHI
R: 5’ cgg aat tcc gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc   3’      EcoRI
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1楼 2015-05-15 17:25:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huachijin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
demiiiii: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答很全面，对我这个小白来说很有帮助 2015-05-17 16:00:03
总体来说感觉很不错啊，但是
1，引物当中应该是不小心复制了两次酶切位点和保护碱基吧？猜测你设计的引物是下面的序列：
F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’    BamHI
R: 5’ c gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc   3’      EcoRI
2， F引物的二级结构可能有点复杂。可以修改保护碱基成cgc。
cgc gg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac
也可以根据目的片断的序列修改保护碱基。对于这两个酶，一般两到三个碱基都可以，三个更好。
3，两个引物的退火温度差别不大，这个很好。因为加了保护碱基和酶切位点，所以退火温度比较高。但是第一次PCR的时候只有后面的序列可以退火，温度在65-67，所以应该没问题的。有没有杂带只能做了PCR才能知道。
4，再比对下序列。
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2楼2015-05-15 19:33:48
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度不需要考虑加入的酶切位点序列和保护碱基序列，只需要计算能与模板结合的引物序列的Tm就可以了
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rainwater
6楼2015-05-16 10:05:28
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普通回帖

demiiiii

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huachijin at 2015-05-15 19:33:48
总体来说感觉很不错啊，但是
1，引物当中应该是不小心复制了两次酶切位点和保护碱基吧？猜测你设计的引物是下面的序列：
F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’    BamHI
R: 5’ c gga att cct tgt ...

谢谢你的回答，对我们来说很有帮助，我想再请问一下，R引物的保护碱基是不是能改成CCT
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3楼2015-05-15 20:55:06
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小蚂蚁虫

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们基本上只考虑一次PCR的引物退火温度 加了酶切位点的引物退火温度我们不考虑
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4楼2015-05-15 22:59:21
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
5楼2015-05-16 09:41:17
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般引物TM值不包含添加的酶切位点的
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7楼2015-05-16 10:47:23
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demiiiii

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小蚂蚁虫 at 2015-05-15 22:59:21
我们基本上只考虑一次PCR的引物退火温度 加了酶切位点的引物退火温度我们不考虑

知道了，谢谢～

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8楼2015-05-17 15:58:34
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demiiiii

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-16 09:41:17
保护碱基对应酶切有个表，会有对应的效率百分比；要知道TM不含保护碱基的

好的，明白了～😊😊

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9楼2015-05-17 16:00:38
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demiiiii

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-05-16 10:05:28
退火温度不需要考虑加入的酶切位点序列和保护碱基序列，只需要计算能与模板结合的引物序列的Tm就可以了

谢谢你的回答～

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10楼2015-05-17 16:09:13
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