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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
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黄xia

金虫 (小有名气)

[交流] 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢 已有8人参与

我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。
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1楼 2015-05-09 21:08:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-10 22:54:42
黄xia: 金币+5, ★★★很有帮助, 您好，由于看到蛋白没挂上，所以心情受到重创就完全忘了拍照，在配平衡缓冲液的时候的确没有加任何咪唑(50mMNaH2PO4·2H2O,300mMNaCl,NaOH调pH至8.0)，您提醒我了，我配20mMTris-HCl 时用了HCl和NaCl调pH值，难道是NaCl把蛋白沉淀掉了？我没考虑过，也不太懂，柱子是没问题，因为其他人用那柱子能挂上，样品自身是否聚合我不知道，不过谢谢你的建议，我会考虑加变性剂试试，也检测一下histag，真得非常感谢 2015-05-11 09:05:52
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5楼2015-05-10 19:13:25
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普通回帖

酒家何处

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 谢谢 2015-05-10 11:03:13
silicare: 屏蔽内容, 违规存档 2016-01-12 15:37:16
本帖内容被屏蔽
2楼2015-05-09 22:49:39
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 您好，我的蛋白应该是表达了的，因为跑SDS-PAGE后，相对转空载的样，在预计的位置出现了一条很粗的条带 2015-05-10 11:02:04
可能是没表达出来，表达出来得话跑sds很明显的。会有很浓的一条呆。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-05-09 23:41:20
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 谢谢，移码的情况倒没有，因为已经分析了很多遍了，看序列都快把眼睛看穿了，而且我也叫其他的同学，老师帮我看了序列，也许真的需要换其他的Ni柱 2015-05-11 08:46:25
有His标签挂不上Ni柱很少见，可能是表达的时候有移码，你再分析一下测序结果，看有没有问题。再就是换一批Ni柱。再就是用离子交换之类的其他方法纯化。
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4楼2015-05-10 12:00:10
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我会试试看 2015-05-11 09:06:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-05-09 23:41:20
可能是没表达出来，表达出来得话跑sds很明显的。会有很浓的一条呆。

你可以把你的蛋白做个50kd蛋白得超滤后，用8  mol尿素变性，在过镍柱试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-05-10 23:27:19
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wanglele87

金虫 (著名写手)
★ ★
黄xia: 金币+2 2015-05-12 22:58:14
可能是his tag被包裹了。换个大点的tag试试。

[ 发自小木虫客户端 ]
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一生不羁放纵爱自由
7楼2015-05-11 01:16:06
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-05-11 01:16:06
可能是his tag被包裹了。换个大点的tag试试。

谢谢你的建议，不过换其他tag，我的需要从合成引物开始，因为之前由于考虑到其他实验，所以我引物的酶切位点和其他载体不兼容，所以这个方法可能留在最后尝试了
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8楼2015-05-11 09:14:27
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-10 19:13:25
如果不挂柱
建议准备几个东西，histag抗体，相应二抗
具体信息不清楚我按我想的说啦
首先你的蛋白有多少不是很清楚，最好有个图，上样前的流穿的，洗脱的
平衡缓冲液中是否有低浓度咪唑，还是一点都没有呢
样 ...

左边是Marker,中间是空载，右边粗的那条带是表达的蛋白，从图上看说明是表达了的，挂柱的图当时由于想着没挂上，就忘拍了，所以图就不能上传了
蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
图.png
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9楼2015-05-11 10:53:41
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
黄xia: 金币+2 2015-05-12 22:58:02
本帖内容被屏蔽
10楼2015-05-11 11:13:28
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