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xcs100: 金币+7 2014-12-30 12:43:28
重组蛋白质的分离纯化是否存在一般顺序
凌波丽
2014年12月30日
结合我个人和别人的工作经验，叙述如下（不一定都正确）:
蛋白质的分离提纯由于不同的蛋白质的彼此差异较大，就普遍而言可能没有特定的分离纯化的固定顺序，不过仍然有一些可以参考的大致的分离纯化流程。因为我的实验工作是与重组蛋白质相关，所以就在这里讨论重组蛋白分离纯化的可作参考的大致的分离纯化流程。一般来说，重组蛋白质的分离纯化比天然蛋白质要容易一些。
一般蛋白质的分离纯化的一般顺序是：粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）、中间纯化操作、最后采用高分辨率的纯化方法进行分离纯化、产物鉴定和保存。
第一步，粗分离。粉碎细胞或提取含有提取分泌到细胞外的表达产物的培养基、沉淀、过滤、初步浓缩（比如超滤）一般也叫粗分离。与天然蛋白质的分离纯化相比，重组蛋白质的分离纯化可以不用先去确定足量表达目的蛋白质的组织与细胞，并且先对这些组织和细胞进行分离和富集，另外由于大肠杆菌表达系统的广泛使用，重组蛋白质往往在大肠杆菌细胞中形成包涵体，如果不用分泌表达的话，这样粉碎了大肠杆菌细胞后只要过滤就可以获得固体的包涵体颗粒。即使要使用酵母细胞、动物细胞和植物细胞表达重组蛋白也往往需要先在大肠杆菌细胞等原核细胞中进行试表达。如果不形成包涵体时，使蛋白质发生沉淀可使用、丙酮、硫酸铵、聚乙烯亚酰胺等化学试剂或者调节溶液的pH值至目的蛋白质的等电点获得沉淀并经过过滤而取出，然后在对沉淀物进行溶解，如果是耐高温的目的蛋白质可以通过加热使得其他蛋白质变性后沉淀，然后提取和保留上清液，上清液里即含有目的蛋白质。包涵体经过离心、沉淀、过滤获得后，也必须使得包涵体溶解，否则后面的分离提纯工作就无法进行了。不易溶解于水的蛋白质可使用去垢剂或表面活性剂增溶 以便达到蛋白质溶解于水的目的，但是不要使用超声波把浑浊的蛋白质溶液“绞”成清亮状态，因为超声波的能量足以打断共价键，使得肽链断裂。不幸的是：一些实验操作者对于超声波发生器似乎有过于强烈的实验需求，可能是因为操作省事，反正强度适当且时间足够，开动超声波发生器肯定是能把浑浊的蛋白质溶液“绞”成清亮状态，超声波连带有肽聚糖细胞壁的大肠杆菌细胞都能粉碎，何况溶液中的蛋白质。简而言之，利用蛋白质的溶解度和抗热性与抗蛋白酶解等特殊性质分离出蛋白质一般是在第一步的粗分离阶段，而不在中间纯化和精细分离这两个步骤进行，粗分离过程也利用蛋白质的密度、分子量大小和形状的特性，蛋白质的后三种性质在后面的中间纯化和精细分离同样会利用到。利用蛋白质的溶解度与抗蛋白酶解等特殊性质有时候在蛋白质产物的质量检测阶段也可能用到。粗分离阶段已经能够去掉相当多的DNA、多糖、脂类、热源、病毒等非蛋白质的杂质成分，但是以后的分离纯化蛋白质的技术环节仍然必须考虑到去除非蛋白质的杂质成分。
第二步，中间纯化。中间纯化阶段一般是利用蛋白质的分子量、形状、电荷性质、等电点、疏水性、密度、与配体的结合能力、与金属的结合能力、与有机小分子（比如某些、染料分子）的结合能力等特性进行蛋白质产物的分离提纯。中间纯化的实验操作普遍地包括各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、金属螯合层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析等，也包括离心、透析、超滤等其他操作穿插其间，不过一般没有电泳，特别是在大规模分离提纯蛋白质时。各种层析方法，比如离子交换层析、疏水层析、亲和层析、等电点聚焦、凝胶过滤层析、金属螯合层析等在中间分离纯化阶段没有完全固定的顺序，虽然一般处理比较大量的样品时，离子交换层析、疏水层析一般先使用，但是有时在凝胶层析之后也可能会用到离子交换层析、疏水层析，比较普遍的情况而言，亲和层析、金属螯合层析不会首先在中间分离阶段的初始时期及使用。
一个离子交换层析介质，无论是阴离子交换柱，还是阳离子交换柱，反正因为蛋白质A的pI=5.0小于缓冲溶液的pH=7.0,而会带上负电荷， 蛋白质B的pI=9.0大于缓冲溶液的pH=7.0，而会带上正电荷，所以必有其一会粘在离子交换层析柱上。具体一些说，因为蛋白质A的pI=5.0小于缓冲溶液的pH=7.0,而会带上负电荷，就会和阴离子交换层析柱结合，比如氨乙基、季胺基、二乙基氨乙基等离子交换层析；蛋白质B的pI=9.0大于缓冲溶液的pH=7.0而净带上正电荷，而与阳离子交换层析柱相结合，比如：羧甲基、磺丙基、磷酸基、磺甲基等的离子交换层析柱结合。上样后，带流出穿透峰（穿透峰不带有蛋白质，面积大，峰宽，且不在280nm处，很容易辨认）之后，无论哪种蛋白质黏在柱上，根据上样液流出的有UV280信号的收集峰的蛋白质必须要收集，而且流出的收集液里必然是另一种蛋白质；然后用稍大一些的离子浓度的缓冲溶液再淋洗数次层析柱，这时的收集液也基本上是不挂柱的那种蛋白质居多；等到UV280响应信号重新回到基线后，用浓度最大的缓冲溶液，比如pH=7.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液（含500mM NaCl）进行洗脱，此时要换个收集瓶收集第二种蛋白质。
至少在我的工作经验，电泳较少用于过中间分离阶段，电泳是用于蛋白质的纯度检验阶段，当然不是唯一检测纯度的手段。中间纯化步骤比较多的是首先使用离子交换层析和疏水层析，而后根据具体情况，可使用等电点聚焦、凝胶过滤层析等其他的层析方法，离心、透析、超滤等其他操作根据需要而穿插其间。再往后可以用亲和层析和金属螯合层析，不要把亲和层析和金属螯合层析一开始就在中间纯化阶段使用，因为样品溶液中的杂质太多，会干扰受体-配体的专一性结合。目的蛋白质中的DNA、多糖、脂类、热源、病毒等非蛋白质成分在中间分离纯化阶段必须要考虑认真去除，虽然粗分离阶段已经能够去掉相当多的非蛋白质的杂质成分。DNA可以用离子交换层析去除，多糖可以用凝集素亲和层析去除。理论上将可以用酶水解掉多糖和DNA，然后通过分子筛层析柱而对两者的降解产物进行去除，但是用于购买酶的费用增加成本太多，而且又加入需要分离纯化处理的新的杂蛋白，所以此种分离纯化方案不可行。脂类可以通过分子筛层析而与蛋白质分离。热源（肠杆菌的内毒素，主要成分是脂多糖）可采用活性炭、石棉等加以吸附，然后离心加以沉淀，而后过滤掉活性炭、石棉（连同吸附的热源物质），留下滤液。另外脂多糖能够对于某些生物分子有亲和吸附，所以可以用多粘菌素B亲和色谱、抗脂多糖的单克隆抗体亲和色谱去除掉热源（肠杆菌的内毒素，主要成分是脂多糖）。除了DNA和热源，蛋白质生产过程中必须考虑到来源于蛋白质产物的细胞病毒污染。终产物中的细胞病毒污染物主要来源与细胞中的内生病毒，因此，充分地对于母细胞库进行病毒筛选和检测尤为重要。在细胞株被用于生产前，主细胞库必须是无病毒的，这将彻底减少在最终的纯化的蛋白质产物中病毒污染的危险。也可专门装置去除病毒，比如用专门的多孔膜或者空心纤维的超滤管过滤掉病毒。
在亲和层析时，我们可以制备出任何一个蛋白质的单克隆抗体，而把单克隆抗体共价结合在凝胶层析柱上，制备成为亲和层析柱，作用含有两种蛋白质的溶液过柱时，被单克隆抗体识别并且结合的那一种蛋白质就被粘在了层析柱上，另一个流出去，黏在柱上的蛋白质可以用中等浓度（0.1-0.2mol/L）的可溶性配体或者类似物在较温和的解吸条件下竞争性地置换结合蛋白质。比较常用的较强酸性的洗脱液（比如pH=2.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液、5mmol/L的pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液）洗脱蛋白质。洗脱下来后应尽快将洗脱液的pH变为中性，避免目的蛋白质失活。
如果蛋白质A的C末端有6个组氨酸的尾巴，所以可以用金属螯合层析的方法加以分离提纯，就是使用含有镍离子的亲和层析柱分离纯化含有的C末端有6个组氨酸的尾巴的蛋白质A。蛋白质A会挂在镍柱上，蛋白质B不挂柱，直接流出，先收集蛋白质B，而后用20mmol/L磷酸缓冲溶液，200mmol/L咪唑，pH8.0缓冲溶液和20mmol/L磷酸缓冲溶液，400mmol/L咪唑，pH8.0缓冲溶液两次洗脱下挂在镍柱上的蛋白质A。
第三步是精细分离纯化。精细分离纯化一般是用凝胶过滤层析和HPLC，这样可以依靠蛋白质的分子量的差别得到比较纯的目的蛋白质产物，而且能够去盐和有机小分子（尤其是在亲和层析和金属螯合层析阶段积累的盐或有机小分子），HPLC过早使用效果不好，杂质过多可能会堵住柱内的填充介质。亲和层析和金属螯合层析一般而言，也不适合作为分离提纯蛋白质工作的最后一步（具体理由会面会讨论）。这三步结束时，一般目的蛋白质样品的浓度会有所降低，而且会有非缓冲溶液的其他的洗脱液，所以有必要用透析、超滤去除小分子和适当浓缩，以利用产物检测和保存。
第四步，产物鉴定。一方面需要检测目的蛋白质的纯度。蛋白质产物的纯度一般可以用SDS-PAGE、蛋白质的溶解度是否均一、HPLC、质谱、生物功能、肽谱分析等检测技术。实际上用红外傅里叶光谱、紫外光谱和圆二色光谱联合检测蛋白质的纯度更容易，而且不会损失样品，即用被检测蛋白质和标准品的有关光谱参数加以对比。另一方面要检测目的蛋白质中的热源、DNA、病毒等非蛋白质成分，特别是对于药用和食用蛋白质，可以用FTIR，MS，被检测的非目的蛋白质的杂质的生物活性检测等。第五步，产物保存。一般而言，如果不是冷敏性的蛋白质可使用冻干机制备为蛋白质干粉状制剂，然后放入0-4摄氏度的冰箱可长期保存，也可将蛋白质放入Eppendorf管，加入适量甘油和缓冲溶液（调节好浓度）后封口并贴上标签，再放入零下70摄氏度冰箱保存。对于冷敏性的蛋白质或者不知低温下是否稳定的蛋白质不能使用低温冻干处理，将蛋白质放入Eppendorf管，加入适量甘油和缓冲溶液（调节好浓度）后封口贴上标签，再放入零下70摄氏度冰箱保存，并且要分批小包装，避免反复冻融。有条件的话，应该使用密闭更佳的工业化的包装。
需要说明的是，蛋白质的分离纯化既要考虑蛋白质终产物的比活性也要考虑蛋白质终产物的总活性，不能一味地追求提高比活性而增加分离纯化的步骤，因为每一步分离纯化都必然会有目的蛋白质的净损失，进而导致总活性的降低。另外大规模生产蛋白质除了更加注重总活性外，还需要考虑生产成本，增加不必要的分离纯化步骤必然会增加产品的生产成本。 |
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以后我么可以继续就具体问题加以讨论。