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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 小白求助纯化酶经验
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1楼 2014-12-29 22:21:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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xcs100: 金币+1 2014-12-31 11:14:07
野生菌产的酶是什么意思？重组酶还是野生酶？
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14楼2014-12-31 07:18:07
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
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17楼: Originally posted by xcs100 at 2014-12-31 11:15:36
就是自然界筛选出来的，没有其它改变遗传手段处理，直接用于产目的酶...

还是没有明白，我见到的分类是野生酶和重组酶。

野生酶是指未经过遗传改造的，比如说我筛选得到一个菌株可以产淀粉酶，我就培养这个菌得到发酵液，发酵液中经过检测含有淀粉酶活力，但是我：1、不知道淀粉酶的基因序列；2、淀粉酶是从原始菌株中得到的，非其它宿主。

重组酶是指：
1、我知道了这个基因编码具有这个功能的酶；
2、我获得了这个基因；
3、我对这个基因进行遗传操作，将这个基因克隆到某个载体上，是为重组；
4、将载体导入某个宿主（原始菌或非原始菌）中进行了该菌株的基因重组；
5、获得了该基因的表达产物。

你是哪个情况？
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18楼2014-12-31 21:48:15
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
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原来如此

一般来说，野生酶的纯化比重组酶难，从你主楼说的来看，你能不能说说你们实验室现有的软件和硬件。
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20楼2014-12-31 22:15:40
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
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xcs100: 金币+5 2015-01-01 01:09:11
也不是就纯化不了，我觉得你需要先买2个空柱，柱床体积不用超过20毫升的，大了就是浪费了，这两个空柱用来装疏水层析和离子交换。空柱不用太高级，不用什么耐压多大材质怎样。空柱或需要更多，2个是绝对要的。蠕动泵和塑料管不一定要，有就更好，可以省一点功夫。

有没有粗酶液？我教你先做一点预备实验。
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22楼2015-01-01 01:01:57
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
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xcs100: 金币+4 2015-01-02 13:44:24
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23楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-01 01:18:56
实验楼有蠕动泵和塑料管。相应的柱子也有，都大于20ml，但是貌似很脏，应该吸附了很多其它的物质，这里就不吐槽其他人的科研素质了。但是没有疏水层析和离子交换树脂，得去买（我只知道买G-75的树脂，其它更贵，不 ...

酶液上柱之前最好是要高速离心，上清液用0.45微米滤膜过滤，再用0.2微米滤膜滤膜。照我的经验，离子交换填料最容易吸附色素，疏水层析填料即使是吸附力最强的苯基都不容易吸附色素，分子筛几乎就不吸附色素的，不知道你们已有的填料是什么填料。我们的是预装柱，不是玻璃的，从09年起，我用过十几根不同的预装柱，一根都没坏。但有一点你要注意，颜色深了不一定就不能用，因为可能还能用来粗分离，除非填料内部空隙堵了洗脱液流不下了，而且重装之后说不定还能用。

相应的柱，什么柱？里面装的是什么填料？柱最好别用玻璃的，要是不小心摔了就完了，当然我没摔过，但就怕万一。

粗酶液特别多，体积和蛋白质各多少？溶液什么状态？
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24楼2015-01-01 03:43:21
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25楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-02 13:44:17
不好意思好，昨天小木虫好像又进不来。上午汇报。
嗯，离心了，也溶解了。下一步先超滤，这个我们这边现有。我查了一下是Z型系列层析柱，好像是有机玻璃的，里面填料。但是我们这几根都特别粗，估计有5厘米左右直 ...

1、溶解了是什么意思？你的酶是野生菌产的，不存在于上清液中？
2、超滤不是必要的步骤。
3、你能不能说说你的是什么酶？
4、特别粗的空柱不合适用，尤其是5厘米左右直径简直是太粗了，得装很多填料。事实上用于实验室纯化的层析柱柱床体积有20毫升就足够了。
5、你的填料如果不能很快到，那你就要注意你现在的酶不能留着上柱，因为酶的性质可能会变化，我就遇到这个情况了，在4度放2个月之后酶的热稳定性变差了，得到了错误的实验结果。
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26楼2015-01-02 23:15:00
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27楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-03 10:28:52
1.我们这菌是胞内酶，得破碎提取；
2.超滤是防止样品液里面的颗粒太多，杂质太多；
3.我们这是脂肪酶；
4.嗯，那我去买10cm 长的那种细柱子看看。
5.嗯，好的谢谢您提醒，这个倒是一般保证一周内使用，放久了我 ...

我印象中脂肪酶是可以分泌到胞外的，你选择胞内的，有什么特别的依据吗？
样品液的颗粒太多是会堵住滤膜的，要先高速离心，过滤，才能除去这些颗粒。
10cm 长的细柱子我不知道是多大，但是这个纯化不是生产用的，而是实验室分析用的，是不必太大体积的。我需要柱床体积20毫升的就足够了。体积大了，需要的填料也多，购买费用也大一些。
填料的话，最好是买苯基的疏水，Q的强阴，是各自吸附能力最强的基团种类，要是都吸附不好，其它的叔丁基的疏水和DEAE的也更加吸附不好。
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28楼2015-01-04 00:02:21
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29楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-04 00:11:34
嗯，好的，谢谢哈，太感谢你们这些无私的前辈们指点了。我们筛选出来的菌株就是胞内酶，这个改不了。我看文献也比较多用苯基疏水柱,脂肪酶也有比较多的疏水基团。但是DEAE的离子交换柱也有不少诶，弱弱地问一下，这 ...

我觉得好奇，你是为什么不选择胞外酶的？你如果要破碎细胞还更麻烦呢，你得保证得率，但是本来有多少酶的你是不知道的；你还得保证破碎过程中不会改变酶的性质，你也不知道超声波和冷冻什么的是不是对酶的性质造成改变。

虽然是同一种酶，同属于一个酶的编号，但具体到你手里的这个酶，性质也还是有可能和别人的不同的。酶的活性和底物专一性主要是由活性中心的氨基酸残基和折叠构成的，而暴露在外的面积何其大，残基何其多，变异何其严重，你想想是不是这个道理。我就比对过很多个酶的氨基酸序列，一致性从高到低的都有，酶的酶学性质也各异，这一点你要肯定的。所以说虽说它山之石可以攻玉，但不一定就完全贴合你的情况。

DEAE是弱吸附的，和强吸附的Q相比，在同等的条件下，会在稍低的洗脱强度下出峰。不是不行，而是说假如Q吸附不上的蛋白质，DEAE就更吸附不上了。

人家实验室没有Q，用已有的DEAE来试一下发现纯了，那就没必要买Q了呗。
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30楼2015-01-04 00:24:34
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31楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-04 00:37:14
哦哦哦。DEAE 和 Q 原来是这个道理啊。
您别奇怪，菌株是一直定着的，用于其它用途，同时呢，又要研究一下它所产酶的酶学性质，所以就得纯化。
嗯，您说得对，新菌株所产酶差异一般还是比较大的。也得有个探索， ...

这个菌株会产胞外的脂肪酶吗，为什么要做胞内的？
不管是不是新菌株，所产的酶的酶学性质都是很难说是不是跟已有报道的一样的，不能肯定其纯化流程是怎样的。
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32楼2015-01-04 01:03:43
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33楼: Originally posted by xcs100 at 2015-01-04 01:17:58
基本上只产胞内酶。好的，先借鉴经验缩小一下预方案的范围，不然瞎整、各种条件全都摸也不是个事儿。唉，首先本来就是个小白，还有就是客观条件也有点不是特别在行这方面，幸好还有你们这些人不断指点，（只是不知 ...

预装柱最好是和纯化仪配套使用，你说的柱子是空柱？我们实验室已经有了，我没买过，你得自己查。你当初怎么确定它只产胞内酶的？胞内酶的话，纯化起来跟胞外酶差不多的，就是最初的产量和破碎方面我不了解。金币方面我不缺，你得问版主是不是发帖的时候还要注意设置什么的。
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34楼2015-01-04 01:34:25
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