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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by mazhenggen at 2015-05-12 11:18:41
可以试试其他原理的层析，像离子交换，疏水都挺好使的。

离子交换我们实验室都没做过，所以不知道怎么做
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21楼2015-05-12 17:16:45
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:54:02
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22楼2015-05-12 17:23:19
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-12 17:23:19
很明显HIS  TAG被蛋白本身包裹，在his之前可以加6个  Gly试试。这样的蛋白为啥不在N端加HIS，如果功能区或者构象影响不大，建议在N端，这个可能表达量更高，也可能HIS不被包裹。不用担心重新构建，这个一般都在1-2周 ...

N端和C端都有功能区，C端离功能区远点，所以在C端设计的，弱弱地问一句，怎么在His之前加6个Gly，用的histag是载体本身自带的
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23楼2015-05-12 18:49:34
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+2, 谢谢，当然能教我如何点突变就更好了，呵呵，不过貌似有点不现实哈 2015-05-12 22:53:39
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24楼2015-05-12 19:51:54
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+2, 不过在引物里面加，那Gly和Histag之间不就隔了酶切位点，这样也可以吗，跟大家交流，虽然还是有很多不懂，但也觉得学到好多东西，谢谢 2015-05-12 22:51:03
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25楼2015-05-12 19:55:41
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肉虫

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:51:29
Tris里面有氨基，可以和金属离子结合，有可能影响蛋白挂柱，不过一般没什么问题，楼主可以试一下磷酸盐的buffer。不过遇到这种问题应该是标签包括在蛋白内部了，换标签吧，GST的SUMO的都可以。
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26楼2015-05-12 20:49:49
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-12 19:51:54
依次点突变环P,很快就OK了。...

这个方法感觉好高大上啊，我不会做，我们实验室有做点突变的，但往往突变的都不是自己希望突变的那个，所以这个依次点突变对我而已无从下手，咋做的哟？但也很感谢你给我的建议
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27楼2015-05-12 22:47:34
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-13 09:10:10
引用回帖:
21楼: Originally posted by 黄xia at 2015-05-12 17:16:45
离子交换我们实验室都没做过，所以不知道怎么做...

有his标签的蛋白不一定亲和就能成功，可能与蛋白本身有关。离交换很好操作，你的蛋白等电点4点几，溶液ph为8，那么此时蛋白带负电荷，选择阴离子交换，目标蛋白结合在填料上，用高盐进行洗脱。具体操作可以参GE公司的离子交换操作手册。如果你没有我可以发给你。

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我喜欢所以我做
28楼2015-05-13 08:54:54
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+4, 嘿嘿，谢谢 2015-05-14 09:02:25
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29楼2015-05-13 10:23:57
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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30楼2015-05-13 10:27:54
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