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黄xia

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[交流] 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢已有8人参与

我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。

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1楼 2015-05-09 21:08:14

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黄xia

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

22楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-12 17:23:19
很明显HIS TAG被蛋白本身包裹，在his之前可以加6个 Gly试试。这样的蛋白为啥不在N端加HIS，如果功能区或者构象影响不大，建议在N端，这个可能表达量更高，也可能HIS不被包裹。不用担心重新构建，这个一般都在1-2周 ...

N端和C端都有功能区，C端离功能区远点，所以在C端设计的，弱弱地问一句，怎么在His之前加6个Gly，用的histag是载体本身自带的