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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
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黄xia

金虫 (小有名气)

[交流] 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢 已有8人参与

我的蛋白70多KD，上清表达，表达量还可以，在C端加了6His标签，用生工的Ni柱填料挂柱纯化，洗脱后，洗脱液中无目的蛋白，只有杂蛋白，目的蛋白在流穿液当中，说明没挂上，（平衡缓冲液pH8.0，蛋白的等电点4.6左右，上样流速尝试过0.4和0.5ml/min），由于没挂上，打算用切非变性胶的方式纯化，来做后续实验，但将切下的胶电透浓缩后，跑SDS-PAGE分析，有很多杂带，目的条带的量也少，与杂带量差不多，在切的过程中，有时候还切不到自己的目的蛋白，怎么办呀，我已经就纯化蛋白这个问题做了很久了，还没啥进展，希望各位有经验的亲给我一些建议，谢谢谢谢........无数个谢谢。
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1楼 2015-05-09 21:08:14
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-13 09:10:10
引用回帖:
21楼: Originally posted by 黄xia at 2015-05-12 17:16:45
离子交换我们实验室都没做过，所以不知道怎么做...

有his标签的蛋白不一定亲和就能成功，可能与蛋白本身有关。离交换很好操作，你的蛋白等电点4点几，溶液ph为8，那么此时蛋白带负电荷，选择阴离子交换，目标蛋白结合在填料上，用高盐进行洗脱。具体操作可以参GE公司的离子交换操作手册。如果你没有我可以发给你。

[ 发自小木虫客户端 ]
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我喜欢所以我做
28楼2015-05-13 08:54:54
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酒家何处

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 谢谢 2015-05-10 11:03:13
silicare: 屏蔽内容, 违规存档 2016-01-12 15:37:16
本帖内容被屏蔽
2楼2015-05-09 22:49:39
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 您好，我的蛋白应该是表达了的，因为跑SDS-PAGE后，相对转空载的样，在预计的位置出现了一条很粗的条带 2015-05-10 11:02:04
可能是没表达出来，表达出来得话跑sds很明显的。会有很浓的一条呆。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-05-09 23:41:20
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 谢谢，移码的情况倒没有，因为已经分析了很多遍了，看序列都快把眼睛看穿了，而且我也叫其他的同学，老师帮我看了序列，也许真的需要换其他的Ni柱 2015-05-11 08:46:25
有His标签挂不上Ni柱很少见，可能是表达的时候有移码，你再分析一下测序结果，看有没有问题。再就是换一批Ni柱。再就是用离子交换之类的其他方法纯化。
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4楼2015-05-10 12:00:10
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