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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
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棉花糖_ONE_

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
黄xia: 金币+5, 好的，谢谢 2015-05-11 18:44:10
楼主首先试下平衡缓冲液用20mM Tris +0.5M Nacl  试试，然后上样前样品用平衡缓冲液稀释一定的倍数，上样洗脱下试试。
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坑爹的专业……
11楼2015-05-11 12:13:34
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kppeng

新虫 (初入文坛)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:54:34
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-10 19:13:25
如果不挂柱
建议准备几个东西，histag抗体，相应二抗
具体信息不清楚我按我想的说啦
首先你的蛋白有多少不是很清楚，最好有个图，上样前的流穿的，洗脱的
平衡缓冲液中是否有低浓度咪唑，还是一点都没有呢
样 ...

nemo88同学说的有道理，楼主可以参考一下。
首先，用histag蛋白阳性对照确认你的ni柱work。
然后，在buffer中添加变性剂如尿素（可先试一下高浓度尿素以确认确实work），打开蛋白质内部可能包裹的histag。（注：如果histag被包裹在蛋白立体结构内部而无法与ni接触，尿素可以破坏氢键从而暴露内部结构）
最后，还不行的话，用histag抗体做个western，看看你SDS-PAGE胶上的条带中是否存在带histag的蛋白。
祝你好运！
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12楼2015-05-11 13:56:14
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-11 11:13:28
你说的那个NaCl  可能我没表达清楚哈
蛋白有盐溶盐析作用，一定浓度的NaCl可以增加蛋白的可溶度，减少蛋白与蛋白之间的非特异性相互作用，只有浓度很高的时候才会促使蛋白沉淀
如果Tris应该只有盐酸调PH，你说盐 ...

我打错了，是用HCl调，不小心加多了，就用NaoH调，跑SDS-PAGE之后有我的目的蛋白，也有6条其他小分子量的杂蛋白
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13楼2015-05-11 18:36:05
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by kppeng at 2015-05-11 13:56:14
nemo88同学说的有道理，楼主可以参考一下。
首先，用histag蛋白阳性对照确认你的ni柱work。
然后，在buffer中添加变性剂如尿素（可先试一下高浓度尿素以确认确实work），打开蛋白质内部可能包裹的histag。（注： ...

谢谢，但有一个问题，就是我想获得的蛋白尽量维持天然的结构，用尿素变性之后还能复性到原来的结构吗
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14楼2015-05-11 18:42:21
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:54:55
本帖内容被屏蔽
15楼2015-05-11 19:53:39
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-11 19:53:39
额   为嘛用氢氧化钠？调过了？^_^

有么有试过电透回收后的蛋白放几天再制备次样品，跑个sds-page同时点上前几天的样品做对照   看看目的蛋白有没有变少、、、...

呵呵，是调过了，没有试过放几天再跑，因为回收后的蛋白量很少，放几天的话，很可能降解得看不到了，所以没做
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16楼2015-05-12 10:49:38
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:55:06
可以试试其他原理的层析，像离子交换，疏水都挺好使的。

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我喜欢所以我做
17楼2015-05-12 11:18:41
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:55:21
本帖内容被屏蔽
18楼2015-05-12 12:45:40
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ray_

新虫 (小有名气)
★ ★
黄xia: 金币+2, 谢谢 2015-05-12 22:55:35
你上柱前有取样跑电泳没，说不定表达量太少

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19楼2015-05-12 13:08:56
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黄xia

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-12 12:45:40
所以你觉着你的蛋白会降解了？那最好还是确定过柱时是否发生了降解，掉了histag...

我重新挂了一次柱，改变了一样上样方法，就是把样和填料结合了8个小时，再放出来，再用流穿液继续上样，但出现很奇怪的结果，左边是上样前（粗的那条是目的条带），中间是流穿液第1次和第2次的，最右边直接用500mM咪唑洗脱的，洗脱液中，目的条带上面居然多出一条带，我用的填料是新的，一次也没用过。
蛋白纯化问题，希望大家给我支支招，成分感谢
图.png
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20楼2015-05-12 17:15:15
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