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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)

[交流] BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题 已有6人参与

请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？
详细：
1. 我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、Phe和Tyr这四个残基一共有38个。
背景：
1） 细菌视紫红质（简称BR），除了在280nm有吸收峰外，在558nm处也有吸收峰（暗适应态），因为此蛋白内部有一个发色团。
2）BR的浓度计算，一般是用在558nm的摩尔消光系数ε558=53000M-1cm-1来计算。

2. 用摩尔消光系数得到的BR浓度vs用考马斯亮蓝法（BSA标曲）得到的浓度
1）我配制一定浓度的BR溶液，测得OD558=0.396，用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml
2）用BSA制备标曲曲线，步骤如下：
称取2.06mg BSA溶于20ml去离子水，母液浓度为0.103mg/ml，与染料作用10分钟，具体参数和标准曲线见图。
用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474，计算得到此蛋白浓度为为49.69ug/ml。
用两种方法测定的蛋白浓度相差约四倍。

疑问：1.为什么会有这样的差异，是因为BSA和BR这两种蛋白的分子量和所含的氨基酸成分不同造成的吗，还是因为BR本身在558nm有吸收峰而造成的影响？
      2. 我有另一个目的蛋白，和BR一样也是细菌类视紫红质，在550nm有特征吸收峰，测定这个蛋白，我是用BSA还是BR来做标准曲线？

谢谢，如果有不清楚的地方，请回帖问我。
BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题
BR光谱扫描.jpg


BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题-1
BSA参数.jpg


BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题-2
BSA标曲.jpg
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我是自己的神
1楼 2013-11-08 10:35:20
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
竟然是用BSA做标准物，那么作标曲，以及测你的样品。
保证体系不变，波长不变就可以了。

不要考虑你样品的最大吸收峰波长了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2013-11-08 13:37:09
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。
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Thank-you，so-blue.
3楼2013-11-08 14:02:30
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小熊笨笨run

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。
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4楼2013-11-08 14:48:40
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weebug

版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。
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天蓝蓝兮日头晒
5楼2013-11-08 14:53:37
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小熊笨笨run at 2013-11-08 14:48:40
你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。

已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性
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我是自己的神
6楼2013-11-12 09:43:25
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weebug at 2013-11-08 14:53:37
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。

用280测我这目的蛋白浓度，测不准。我的蛋白是一种嗜盐杆菌膜上的膜蛋白，蛋白提取是通过蔗糖梯度离心来纯化的。测浓度时，蛋白的状态是磷脂-蛋白复合物。我想，这一点是不是造成大误差的原因。
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我是自己的神
7楼2013-11-12 09:46:46
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 14:02:30
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。

感谢回复，光程是1cm，至于溶液条件，我去查查最初的原始文献。
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我是自己的神
8楼2013-11-12 09:48:16
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萝莉胖

铜虫 (小有名气)
补充一条件，目的蛋白BR，是一种位于嗜盐杆菌膜上的七跨膜蛋白，天然状态下，在膜上形成稳定的3聚体蛋白-磷脂复合体。纯化此蛋白是用蔗糖梯度离心法，最后得到的目的蛋白样品是“BR三聚体-磷脂”复合物，我想是否鉴于它是膜蛋白，而且与磷脂形成复合物，所以影响了样品与考马斯亮蓝的作用，使得用考马斯亮蓝法测定的浓度偏小。 用558nm的摩尔消光系数法测定的浓度是绝对正确的，因为原理是通过测定它的配体“视黄醛”来确定的，蛋白和配体以摩尔比1:1结合。确定上述问题的目的是，为了测定我的另一个与BR性质相近的蛋白。
PS：功能区的摩尔消光系数比较难测定。
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我是自己的神
9楼2013-11-12 09:59:38
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小熊笨笨run

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 萝莉胖 at 2013-11-12 09:43:25
已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性...

你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是。
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10楼2013-11-12 18:32:36
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