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我是自己的神

1楼2013-11-08 10:35:20

susizheng

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竟然是用BSA做标准物，那么作标曲，以及测你的样品。
保证体系不变，波长不变就可以了。

不要考虑你样品的最大吸收峰波长了。

Thank-you，so-blue.

2楼2013-11-08 13:37:09

susizheng

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不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。

Thank-you，so-blue.

3楼2013-11-08 14:02:30

小熊笨笨run

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你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。

4楼2013-11-08 14:48:40

weebug

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用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。

天蓝蓝兮日头晒

5楼2013-11-08 14:53:37

萝莉胖

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4楼: Originally posted by 小熊笨笨run at 2013-11-08 14:48:40
你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。

已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性

我是自己的神

6楼2013-11-12 09:43:25

萝莉胖

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5楼: Originally posted by weebug at 2013-11-08 14:53:37
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。

用280测我这目的蛋白浓度，测不准。我的蛋白是一种嗜盐杆菌膜上的膜蛋白，蛋白提取是通过蔗糖梯度离心来纯化的。测浓度时，蛋白的状态是磷脂-蛋白复合物。我想，这一点是不是造成大误差的原因。

我是自己的神

7楼2013-11-12 09:46:46

萝莉胖

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3楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 14:02:30
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。

感谢回复，光程是1cm，至于溶液条件，我去查查最初的原始文献。

我是自己的神

8楼2013-11-12 09:48:16

萝莉胖

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补充一条件，目的蛋白BR，是一种位于嗜盐杆菌膜上的七跨膜蛋白，天然状态下，在膜上形成稳定的3聚体蛋白-磷脂复合体。纯化此蛋白是用蔗糖梯度离心法，最后得到的目的蛋白样品是“BR三聚体-磷脂”复合物，我想是否鉴于它是膜蛋白，而且与磷脂形成复合物，所以影响了样品与考马斯亮蓝的作用，使得用考马斯亮蓝法测定的浓度偏小。用558nm的摩尔消光系数法测定的浓度是绝对正确的，因为原理是通过测定它的配体“视黄醛”来确定的，蛋白和配体以摩尔比1:1结合。确定上述问题的目的是，为了测定我的另一个与BR性质相近的蛋白。
PS：功能区的摩尔消光系数比较难测定。

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9楼2013-11-12 09:59:38

小熊笨笨run

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6楼: Originally posted by 萝莉胖 at 2013-11-12 09:43:25
已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性...

你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是。

10楼2013-11-12 18:32:36