应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题
151/2返回列表12下一页
查看: 5242  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

萝莉胖

铜虫 (小有名气)

[交流] BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题 已有6人参与

请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？
详细：
1. 我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、Phe和Tyr这四个残基一共有38个。
背景：
1） 细菌视紫红质（简称BR），除了在280nm有吸收峰外，在558nm处也有吸收峰（暗适应态），因为此蛋白内部有一个发色团。
2）BR的浓度计算，一般是用在558nm的摩尔消光系数ε558=53000M-1cm-1来计算。

2. 用摩尔消光系数得到的BR浓度vs用考马斯亮蓝法（BSA标曲）得到的浓度
1）我配制一定浓度的BR溶液，测得OD558=0.396，用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml
2）用BSA制备标曲曲线，步骤如下：
称取2.06mg BSA溶于20ml去离子水，母液浓度为0.103mg/ml，与染料作用10分钟，具体参数和标准曲线见图。
用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474，计算得到此蛋白浓度为为49.69ug/ml。
用两种方法测定的蛋白浓度相差约四倍。

疑问：1.为什么会有这样的差异，是因为BSA和BR这两种蛋白的分子量和所含的氨基酸成分不同造成的吗，还是因为BR本身在558nm有吸收峰而造成的影响？
      2. 我有另一个目的蛋白，和BR一样也是细菌类视紫红质，在550nm有特征吸收峰，测定这个蛋白，我是用BSA还是BR来做标准曲线？

谢谢，如果有不清楚的地方，请回帖问我。
BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题
BR光谱扫描.jpg


BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题-1
BSA参数.jpg


BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题-2
BSA标曲.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

木虫收藏

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我是自己的神
1楼 2013-11-08 10:35:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
竟然是用BSA做标准物，那么作标曲，以及测你的样品。
保证体系不变，波长不变就可以了。

不要考虑你样品的最大吸收峰波长了。
赞一下 回复此楼
Thank-you，so-blue.
2楼2013-11-08 13:37:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。
赞一下 回复此楼
Thank-you，so-blue.
3楼2013-11-08 14:02:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小熊笨笨run

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-08 14:48:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weebug

版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。
赞一下 回复此楼
天蓝蓝兮日头晒
5楼2013-11-08 14:53:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小熊笨笨run at 2013-11-08 14:48:40
你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。

已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性
赞一下 回复此楼
我是自己的神
6楼2013-11-12 09:43:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weebug at 2013-11-08 14:53:37
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。

用280测我这目的蛋白浓度，测不准。我的蛋白是一种嗜盐杆菌膜上的膜蛋白，蛋白提取是通过蔗糖梯度离心来纯化的。测浓度时，蛋白的状态是磷脂-蛋白复合物。我想，这一点是不是造成大误差的原因。
赞一下 回复此楼
我是自己的神
7楼2013-11-12 09:46:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萝莉胖

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 14:02:30
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。

感谢回复，光程是1cm，至于溶液条件，我去查查最初的原始文献。
赞一下 回复此楼
我是自己的神
8楼2013-11-12 09:48:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

萝莉胖

铜虫 (小有名气)
补充一条件，目的蛋白BR，是一种位于嗜盐杆菌膜上的七跨膜蛋白，天然状态下，在膜上形成稳定的3聚体蛋白-磷脂复合体。纯化此蛋白是用蔗糖梯度离心法，最后得到的目的蛋白样品是“BR三聚体-磷脂”复合物，我想是否鉴于它是膜蛋白，而且与磷脂形成复合物，所以影响了样品与考马斯亮蓝的作用，使得用考马斯亮蓝法测定的浓度偏小。 用558nm的摩尔消光系数法测定的浓度是绝对正确的，因为原理是通过测定它的配体“视黄醛”来确定的，蛋白和配体以摩尔比1:1结合。确定上述问题的目的是，为了测定我的另一个与BR性质相近的蛋白。
PS：功能区的摩尔消光系数比较难测定。
赞一下 回复此楼
我是自己的神
9楼2013-11-12 09:59:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小熊笨笨run

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 萝莉胖 at 2013-11-12 09:43:25
已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性...

你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是。
赞一下 回复此楼
10楼2013-11-12 18:32:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 萝莉胖 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +5 生物工程调剂 2026-03-17 9/450 2026-03-21 23:32 by zhujy1982
[考研] 354求调剂 +6 Tyoumou 2026-03-18 9/450 2026-03-21 20:47 by lbsjt
[考研] 材料工程专硕 348分求调剂 +3 冬辞. 2026-03-17 5/250 2026-03-21 18:47 by 学员8dgXkO
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 白QF 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:12 by zhukairuo
[考研] 材料学学硕080502 337求调剂-一志愿华中科技大学 +4 顺顺顺mr 2026-03-18 5/250 2026-03-21 10:22 by luoyongfeng
[考研] 346求调剂[0856] +4 WayneLim327 2026-03-16 7/350 2026-03-21 04:02 by JourneyLucky
[考研] 324分 085600材料化工求调剂 +4 llllkkkhh 2026-03-18 4/200 2026-03-21 01:24 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +3 阿姐阿姐家啊 2026-03-18 3/150 2026-03-20 23:24 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 +8 安全上岸！ 2026-03-16 8/400 2026-03-20 22:13 by luoyongfeng
[考研] 材料与化工 322求调剂 +4 然11 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:12 by luoyongfeng
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 材料学硕297已过四六级求调剂推荐 +11 adaie 2026-03-19 11/550 2026-03-20 21:30 by laoshidan
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +22 rare12345 2026-03-18 22/1100 2026-03-20 20:39 by zhukairuo
[考研] 289求调剂 +6 怀瑾握瑜l 2026-03-20 6/300 2026-03-20 20:30 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +7 困于星晨 2026-03-17 9/450 2026-03-20 17:38 by 无懈可击111
[考研] 生物学071000 329分求调剂 +3 我爱生物生物爱� 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:12 by macy2011
[考博] 26申博 +4 八6八68 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭