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BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题已有6人参与
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请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？ 详细： 1. 我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、Phe和Tyr这四个残基一共有38个。 背景： 1） 细菌视紫红质（简称BR），除了在280nm有吸收峰外，在558nm处也有吸收峰（暗适应态），因为此蛋白内部有一个发色团。 2）BR的浓度计算，一般是用在558nm的摩尔消光系数ε558=53000M-1cm-1来计算。 2. 用摩尔消光系数得到的BR浓度vs用考马斯亮蓝法（BSA标曲）得到的浓度 1）我配制一定浓度的BR溶液，测得OD558=0.396，用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml 2）用BSA制备标曲曲线，步骤如下： 称取2.06mg BSA溶于20ml去离子水，母液浓度为0.103mg/ml，与染料作用10分钟，具体参数和标准曲线见图。 用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474，计算得到此蛋白浓度为为49.69ug/ml。 用两种方法测定的蛋白浓度相差约四倍。 疑问：1.为什么会有这样的差异，是因为BSA和BR这两种蛋白的分子量和所含的氨基酸成分不同造成的吗，还是因为BR本身在558nm有吸收峰而造成的影响？ 2. 我有另一个目的蛋白，和BR一样也是细菌类视紫红质，在550nm有特征吸收峰，测定这个蛋白，我是用BSA还是BR来做标准曲线？ 谢谢，如果有不清楚的地方，请回帖问我。  BR光谱扫描.jpg  BSA参数.jpg  BSA标曲.jpg |
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10楼2013-11-12 18:32:36
susizheng
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