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断翼的天使

金虫 (小有名气)

[交流] 采用考马斯亮蓝法测蛋白酶活 已有7人参与

如果采用考马斯亮蓝法测蛋白酶活,测出吸光度后,如何计算酶活呢?
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shiliu2011

木虫 (正式写手)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
此法是用来定量蛋白啊!单位当然是ug/ul  or mg/ml之类了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-04-12 02:28:30
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mada1986

木虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的蛋白酶也是蛋白啊 这个怎么测?
3楼2013-04-12 10:48:37
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lishuelishue

银虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
laozuzunzhe: 金币+3, 鼓励交流! 2013-04-12 23:22:26
你只能定量蛋白有多少啊,怎么能测定出酶活?就算是酶也是蛋白,但是你测出的也是酶量啊,不是酶活。、。。
4楼2013-04-12 21:39:25
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windmaple

金虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果你确定是用来测酶活(考马斯为该酶特异性底物),可以考虑用下面的公式套一下:
   酶活力(U/L)=n×△A×10^6×V总/=m×t×V酶
   式中:n为酶液稀释倍数
      V总为反应总体积
      V酶为反应酶液体积
      △A为反应液在t内吸光值的变化值
      t为反应时间(min)
      m为考马斯氧化态的摩尔吸光系数(cm-1mol-1L)

[ Last edited by windmaple on 2013-4-14 at 09:14 ]
5楼2013-04-14 09:04:36
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chengjg

木虫 (正式写手)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个蛋白酶酶活好像是采用福林酚法测定呢吧,用干酪素做底物.
6楼2013-04-15 08:11:46
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断翼的天使

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by chengjg at 2013-04-15 08:11:46
这个蛋白酶酶活好像是采用福林酚法测定呢吧,用干酪素做底物.

这个是可以,但这种方法耗费时间比较长,我要测得又比较多,因此想看看有没有其他办法?
7楼2013-04-16 16:40:57
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断翼的天使

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by windmaple at 2013-04-14 09:04:36
如果你确定是用来测酶活(考马斯为该酶特异性底物),可以考虑用下面的公式套一下:
   酶活力(U/L)=n×△A×10^6×V总/=m×t×V酶
   式中:n为酶液稀释倍数
      V总为反应总体积
       ...

我测得结果只有最后的吸光度,因此 △A没法求,还有m为考马斯氧化态的摩尔吸光系数(cm-1mol-1L)是怎么算的呢?
8楼2013-04-16 16:43:14
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断翼的天使

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lishuelishue at 2013-04-12 21:39:25
你只能定量蛋白有多少啊,怎么能测定出酶活?就算是酶也是蛋白,但是你测出的也是酶量啊,不是酶活。、。。

蛋白酶酶活测定方法及原理
Protease activity assay method and principle
方法        原理
福林酚法        福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物,而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等,可使蛋白质及其水解产物呈上述反应,利用此原理测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法        考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合,主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色,在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。
按照这个最后可以得出蛋白含量,但是如何换算成酶活呢?
9楼2013-04-16 16:51:06
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断翼的天使

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shiliu2011 at 2013-04-12 02:28:30
此法是用来定量蛋白啊!单位当然是ug/ul  or mg/ml之类了

是的,就是要定量蛋白酶酶活的含量。
10楼2013-04-16 16:52:43
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