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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » p不出目标片段
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

[求助] p不出目标片段 已有3人参与

提取16sDNA。20微升pcr的时候得到了目的片段。于是那pcr产物继续pcr，体系按比例扩大成50微升。但这时p不出条带了。如图：右边是marker，目标1500bp片段应平行于marker第三个条带。

p不出目标片段
IMG_20150507_002115.JPG
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1楼 2015-05-07 00:23:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
模板浓度过高？
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2楼2015-05-07 03:31:13
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物不好有二聚体，还有你确定切下了目的条带
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123456
3楼2015-05-07 10:36:58
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一个不小心就: 金币+3 2015-05-09 10:57:57
PCR产物再次PCR，问题就有很多，但最重要的原因还是从模板考虑。一次产物的模板要进行鉴定在二次P，模板浓度要稀释100-1000倍，而且二次PCR本身极易产生错配，引物搞不好会新村二聚体，所以使用特异性高的试剂盒扩增，
此外，切胶回收的时候模板可能出现问题，所以操作要注意。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-05-07 13:16:39
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一个不小心就: 金币+2 2015-05-09 10:58:04
本帖内容被屏蔽
5楼2015-05-09 09:58:07
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-09 09:58:07
模板片段太多；这个需要稀释模板；还有就是体系大，退火时间等需要略长一些

如你所说，模板改变以后就成功了
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6楼2015-05-09 11:00:05
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-07 13:16:39
PCR产物再次PCR，问题就有很多，但最重要的原因还是从模板考虑。一次产物的模板要进行鉴定在二次P，模板浓度要稀释100-1000倍，而且二次PCR本身极易产生错配，引物搞不好会新村二聚体，所以使用特异性高的试剂盒扩增 ...

确实是模板的问题。现在成功了。有意思的是，我的胶回收后的产物浓度已经比较低了，10ng/μl以内，居然还是p不出来。
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7楼2015-05-09 11:02:35
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-05-09 11:14:56
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