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chicktrick铁虫 (初入文坛)
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原核表达相关问题 已有2人参与
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小弟我最近在做原核表达 可是出现了一个奇怪的问题 希望各位前辈能够帮助一下 首先是年前做的原核表达 用了500ml菌液 iptg浓度应该是600ul每升 28度诱导过夜 破碎之后过his镍柱进行纯化 跑胶得到的片段 DSC_0031.JPG marker后面是超声波破碎之后的全菌液以及过柱回收之后的带his标签的蛋白 年后回来再次做的时候 采用磁珠进行纯化 可是发现效果很差没有条带 于是重新转化之后又做了一次验证  mmexport1429325801859.jpg 其中123是不同的iptg 分别是100ul每升 200ul每升和400ul每升 诱导温度是20度过夜 a是1.5ml菌液离心加入loadingbuffer和巯基乙醇进行煮沸后取上清上样 b是超声波破碎之后取上清上样 c是超声波破碎之后取沉淀上样 ck是不加iptg的对照组 步骤同a 但是这次每个重复只使用了50ml的菌液 请问这种情况为什么会出现  还有下面几个问题 1 我估计这是因为his柱纯化时上样量很大导致的差异 是不是出现了包涵体问题？ 2 如果出现包涵体 应该怎么解决 3 目的蛋白是一个转录因子 如果出现包涵体之后进行复性那么他还有没有活性 能否用于下一步实验 4 自诱导培养基能否避免这种情况出现 谢谢各位 |
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