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chicktrick

铁虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达相关问题 已有2人参与

小弟我最近在做原核表达 可是出现了一个奇怪的问题 希望各位前辈能够帮助一下 首先是年前做的原核表达 用了500ml菌液 iptg浓度应该是600ul每升 28度诱导过夜 破碎之后过his镍柱进行纯化 跑胶得到的片段原核表达相关问题
DSC_0031.JPG
marker后面是超声波破碎之后的全菌液以及过柱回收之后的带his标签的蛋白
年后回来再次做的时候 采用磁珠进行纯化 可是发现效果很差没有条带 于是重新转化之后又做了一次验证原核表达相关问题-1
mmexport1429325801859.jpg 其中123是不同的iptg 分别是100ul每升 200ul每升和400ul每升 诱导温度是20度过夜  a是1.5ml菌液离心加入loadingbuffer和巯基乙醇进行煮沸后取上清上样 b是超声波破碎之后取上清上样 c是超声波破碎之后取沉淀上样 ck是不加iptg的对照组 步骤同a 但是这次每个重复只使用了50ml的菌液 请问这种情况为什么会出现
还有下面几个问题
1 我估计这是因为his柱纯化时上样量很大导致的差异  是不是出现了包涵体问题？
2 如果出现包涵体 应该怎么解决
3 目的蛋白是一个转录因子 如果出现包涵体之后进行复性那么他还有没有活性 能否用于下一步实验
4 自诱导培养基能否避免这种情况出现
谢谢各位
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1楼 2015-04-20 00:01:43
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对你的主要问题进行如下解答：
1. 如果在常规超声功率及时间下，你这个结果显示的是大部分蛋白都是包涵体；
2. 如果包涵体复性的话，更多不确定因素，所以摸索诱导剂浓度、诱导温度都是可行的。你可以试试16℃、IPTG浓度为0.1mM/L 下过夜表达的效果。
3. 自诱导系统式把IPTG换成乳糖，有一定的作用，你可以尝试一下。
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没有命运，只有选择！
2楼2015-04-20 10:55:24
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是用保种的菌株做得么？怎么保存的？多长时间？有可能在保存时失活了。
根据你的图来看，应该是蛋白全沉淀到包涵体中了，建议做个蛋白复性看看。
包涵体复性成功后可以使蛋白恢复到类似的天然构型，是否可以用于实验取决于你的实验目的
没试过自诱导培养基，但看介绍可以提高蛋白表达量和避免IPTG毒性，可是对于你的蛋白还是有可能形成包涵体的。
PS：话说你上面那张图怎么跑成这个样子，我对比了半天没确定目的条带，只好推测下图中c条带中最粗的那几条是目的蛋白，如果不是那就抱歉啦。
赞一下 回复此楼
早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
3楼2015-04-20 11:18:02
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