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玻璃花1

金虫 (小有名气)

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[求助] real time PCR引物如何验证？已有1人参与

本人在做real time PCR，之前的引物有150bp,130bp的，用常规的PCR很好验证，并且进行了realtime的实验，最近在做另外几个基因的引物验证，长度80几bp,PCR效果不好，好多杂带，目的片段看不到，请大神们帮帮忙分析分析，引物序列肯定是没问题的，想问问大家都是怎么验证引物的合理性的？实验室也没人做过这方面的，真是苦死了···跪求解答

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1楼 2015-04-11 09:56:22

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wrongfeng

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
玻璃花1: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-04-12 22:00:13

用引物做real time PCR上机实验，
1、设置溶解曲线步骤，如果结果显示溶解曲线是单峰而且退火温度跟预测值相符，说明引物特异；如果溶解曲线多峰，引物有非特异性扩增，弃之不用。
2、将模板DNA设置稀释梯度，计算引物的扩增效率。

我一般是目的基因多设计几对引物，通过实验，选择好的用。

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