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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 错用了real-time的引物 我这些条带会是引物二聚体吗
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

[求助] 错用了real-time的引物 我这些条带会是引物二聚体吗 已有1人参与

第一次提RNA，用TRIzol提取细胞RNA（细胞量稍微有点少），两步法扩增--cDNA--RT-PCR--琼脂糖凝胶电泳

错用了real-time的引物，这些100 附近的带会是引物二聚体吗？      maker上的有点少，不太清楚。。。凑后看吧。。。

泳道 2-7 是目的基因，来自于不同细胞样本，后面8-13是相应内参。     


求解答，谢谢

错用了real-time的引物  我这些条带会是引物二聚体吗
截图00.png
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1楼 2015-03-29 22:01:15
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-01 22:43:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by Greatbpo at 2015-03-31 17:08:41
不是说引物二聚体条带会弥散吗   我的引物大约20bp   要P的产物都是100多不到200bp        

有什么方法能估算引物而具体的大小吗？

这些引物P过小鼠的胚胎干细胞的基因，效果不错，我现在在做同种小鼠的另一种 ...

理论上而言，同物种不同组织只要是都表达，肯定可以扩增出来。你的目标片段本身很小，所以不排除引物二聚体可能。建议以后只要有条件，均带空白对照和阳性对照

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8楼2015-03-31 18:01:22
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
补充一下  前后引物各 1ul   cDNA从20ul 中取出2ul 加入  50ul 体系，
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2楼2015-03-29 22:13:56
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
你的目标片段是多少?引物能与模板匹配吗？

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3楼2015-03-30 00:34:06
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-30 00:34:06
你的目标片段是多少?引物能与模板匹配吗？

请问  这个GAPDH 应该没错吧
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4楼2015-03-31 13:45:52
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Greatbpo at 2015-03-31 13:45:52
请问  这个GAPDH 应该没错吧...

gapdh内参大小也与你引物设计有关。所以，根据大小是否符合预期来做简单判断。其实根据mark来看，gapdh只有100左右，你的目标片段在100以下，引物二聚体可能性很大。如果想验证，可以加水做空白对照，看是否还有

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5楼2015-03-31 15:32:19
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-31 15:32:19
gapdh内参大小也与你引物设计有关。所以，根据大小是否符合预期来做简单判断。其实根据mark来看，gapdh只有100左右，你的目标片段在100以下，引物二聚体可能性很大。如果想验证，可以加水做空白对照，看是否还有
...

好的  谢谢 设计的都是100多  不到200bp   只好做一下空白了
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6楼2015-03-31 16:56:38
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
不是说引物二聚体条带会弥散吗   我的引物大约20bp   要P的产物都是100多不到200bp        

有什么方法能估算引物而具体的大小吗？

这些引物P过小鼠的胚胎干细胞的基因，效果不错，我现在在做同种小鼠的另一种细胞的相关基因表达，引物设计应该没问题吧。
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7楼2015-03-31 17:08:41
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-31 18:01:22
理论上而言，同物种不同组织只要是都表达，肯定可以扩增出来。你的目标片段本身很小，所以不排除引物二聚体可能。建议以后只要有条件，均带空白对照和阳性对照
...

谢谢啦！   第一次做  太缺乏经验了，以后还得多多注意。
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9楼2015-03-31 18:20:47
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Greatbpo

木虫 (正式写手)
你也没点应助，怎么给你金币呢
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10楼2015-03-31 18:24:08
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