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Greatbpo

木虫 (正式写手)

[求助] 错用了real-time的引物 我这些条带会是引物二聚体吗 已有1人参与

第一次提RNA,用TRIzol提取细胞RNA(细胞量稍微有点少),两步法扩增--cDNA--RT-PCR--琼脂糖凝胶电泳

错用了real-time的引物,这些100 附近的带会是引物二聚体吗?      maker上的有点少,不太清楚。。。凑后看吧。。。

泳道 2-7 是目的基因,来自于不同细胞样本,后面8-13是相应内参。     


求解答,谢谢

错用了real-time的引物  我这些条带会是引物二聚体吗
截图00.png
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-01 22:43:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by Greatbpo at 2015-03-31 17:08:41
不是说引物二聚体条带会弥散吗   我的引物大约20bp   要P的产物都是100多不到200bp        

有什么方法能估算引物而具体的大小吗?

这些引物P过小鼠的胚胎干细胞的基因,效果不错,我现在在做同种小鼠的另一种 ...

理论上而言,同物种不同组织只要是都表达,肯定可以扩增出来。你的目标片段本身很小,所以不排除引物二聚体可能。建议以后只要有条件,均带空白对照和阳性对照

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2015-03-31 18:01:22
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普通回帖

Greatbpo

木虫 (正式写手)

补充一下  前后引物各 1ul   cDNA从20ul 中取出2ul 加入  50ul 体系,
2楼2015-03-29 22:13:56
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

你的目标片段是多少?引物能与模板匹配吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-03-30 00:34:06
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-30 00:34:06
你的目标片段是多少?引物能与模板匹配吗?

请问  这个GAPDH 应该没错吧
4楼2015-03-31 13:45:52
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Greatbpo at 2015-03-31 13:45:52
请问  这个GAPDH 应该没错吧...

gapdh内参大小也与你引物设计有关。所以,根据大小是否符合预期来做简单判断。其实根据mark来看,gapdh只有100左右,你的目标片段在100以下,引物二聚体可能性很大。如果想验证,可以加水做空白对照,看是否还有

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2015-03-31 15:32:19
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-31 15:32:19
gapdh内参大小也与你引物设计有关。所以,根据大小是否符合预期来做简单判断。其实根据mark来看,gapdh只有100左右,你的目标片段在100以下,引物二聚体可能性很大。如果想验证,可以加水做空白对照,看是否还有
...

好的  谢谢 设计的都是100多  不到200bp   只好做一下空白了
6楼2015-03-31 16:56:38
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

不是说引物二聚体条带会弥散吗   我的引物大约20bp   要P的产物都是100多不到200bp        

有什么方法能估算引物而具体的大小吗?

这些引物P过小鼠的胚胎干细胞的基因,效果不错,我现在在做同种小鼠的另一种细胞的相关基因表达,引物设计应该没问题吧。
7楼2015-03-31 17:08:41
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhouking8758 at 2015-03-31 18:01:22
理论上而言,同物种不同组织只要是都表达,肯定可以扩增出来。你的目标片段本身很小,所以不排除引物二聚体可能。建议以后只要有条件,均带空白对照和阳性对照
...

谢谢啦!   第一次做  太缺乏经验了,以后还得多多注意。
9楼2015-03-31 18:20:47
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Greatbpo

木虫 (正式写手)

你也没点应助,怎么给你金币呢
10楼2015-03-31 18:24:08
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