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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 蛋白电泳跑成这样是怎么回事啊？
汕头大学海洋科学接受调剂
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白电泳跑成这样是怎么回事啊？ 已有4人参与

我对转化后的大肠杆菌诱导了一下，然后检测目的蛋白是否表达，但是跑出来的胶是这个样子的，根本看不出来条带，怎么回事啊？向各路大神求教。是制备样品的方法不对吗？我是取1ml菌液，12000rpm离心1min，将菌体用50ul的10%SDS重新悬浮，再加50ul的上样缓冲液，100℃加热10min，离心，上样。还是我做的胶有问题啊？我下一步应该怎么做呢？

蛋白电泳跑成这样是怎么回事啊？
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1楼 2015-04-05 10:16:33
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胡程

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
温室里的杂草: 金币+3, ★有帮助 2015-04-06 09:34:11
我怀疑是菌体太浓，我做样的时候是用1.2毫升菌体，40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的，上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少，10微升足够了吧
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做最好的自己
2楼2015-04-05 11:07:26
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 胡程 at 2015-04-05 11:07:26
我怀疑是菌体太浓，我做样的时候是用1.2毫升菌体，40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的，上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少，10微升足够了吧

好的，谢谢，我做一下试试看
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3楼2015-04-06 09:34:18
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 胡程 at 2015-04-05 11:07:26
我怀疑是菌体太浓，我做样的时候是用1.2毫升菌体，40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的，上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少，10微升足够了吧

我还想问一下你处理菌液的方法是加热吗？加热以后是直接上样还是离心取上清啊？
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4楼2015-04-06 09:39:11
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胡程

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 温室里的杂草 at 2015-04-06 09:39:11
我还想问一下你处理菌液的方法是加热吗？加热以后是直接上样还是离心取上清啊？...

100℃煮沸，然后12000rpm，10min离心取上清（中间有菌体，不离心不好吸）
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做最好的自己
5楼2015-04-06 19:08:16
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
温室里的杂草: 金币+1, ★有帮助 2015-04-08 17:22:30
样品太浓，你可以取样前测一下菌密度，按比例取菌液电泳！
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I am not a hero , but I served with heroes！
6楼2015-04-06 21:41:46
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wlt728 at 2015-04-06 21:41:46
样品太浓，你可以取样前测一下菌密度，按比例取菌液电泳！

是通过OD600测密度吗？按照什么比例取菌液啊？
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7楼2015-04-07 17:20:56
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叶晓波1572

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
温室里的杂草: 金币+1, ★有帮助 2015-04-08 17:22:04
marker 与样品上样量均太多，都溢到相邻的泳道上去了。应该都减少上样量。另外，检测诱导蛋白的表达，应该加一个阴性对照（空载体转表达宿主菌的诱导样品）。
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8楼2015-04-08 14:16:05
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bao可雅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人建议：你的marker跑的也有问题，只是没有样品的问题严重，不仅仅是样品的问题，你的样品浓度肯定很浓，并且你要考虑一下制胶过程中的各种成分的比例，
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9楼2015-04-08 14:16:48
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