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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助哪位用琼脂糖电泳跑过蛋白的高手
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魔音涟漪

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助哪位用琼脂糖电泳跑过蛋白的高手已有2人参与

求助大神，我的样品分子量最大有1000KDa,所以想用琼脂糖凝胶电泳跑一下，不需要特别精确的，我只是要看一下他们变化的趋势，但是第一次尝试用的1%的琼脂糖凝胶，没有加EB，样品未处理，跑出来我是用考马斯亮蓝染色然后脱色的，但是什么也没有，是不是因为没有处理样品，还是电泳缓冲液需要换一下？求大神指导
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1楼2013-12-03 10:18:16
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-03 12:31:20
有没有用表面活性剂？不用活性剂肯定跑不出来
1 蛋白质的二级结构没有被破坏 三维形态会影响摩擦力
2 不同蛋白的pI不同 在胶中前进的速率不一样

PAGE中加入的表面活性剂（SDS等）会以固定比例结合在肽键上 破坏原有的扭曲 使肽链成为一条长链
并且 因为每个肽键结合固定数量的带电分子 因此 肽链的带电量和其长度基本成正比（肽链越长 肽键越多）
从而使得它们在胶中的行进速率成比例
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2楼2013-12-03 11:38:35
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魔音涟漪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Davidzjy at 2013-12-03 11:38:35
有没有用表面活性剂？不用活性剂肯定跑不出来
1 蛋白质的二级结构没有被破坏 三维形态会影响摩擦力
2 不同蛋白的pI不同 在胶中前进的速率不一样

PAGE中加入的表面活性剂（SDS等）会以固定比例结合在肽键上  ...

那我试一试在样品中加入SDS吗?那电泳缓冲液也需要换成PAGE的吗
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3楼2013-12-03 13:14:59
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得还是安安心心的跑PAGE才是正道
实在不行就去找一些琼脂糖跑蛋白的protocol
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4楼2013-12-03 13:22:22
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魔音涟漪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Davidzjy at 2013-12-03 13:22:22
我觉得还是安安心心的跑PAGE才是正道
实在不行就去找一些琼脂糖跑蛋白的protocol

我的样品之前跑过page了，但是他是1000KDa，PAGE不是最大也就二三百吗？
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5楼2013-12-03 14:14:34
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-27 15:02:33
肯定要处理样品啊。蛋白不带电荷怎么跑？
蛋白变性加SDS，胶也要SDS，而且胶的pH很重要。
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6楼2013-12-27 10:45:08
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:17:19
这么大的东东就用SEC凑合看看吧.
至于分子量,我觉得1000kDa用SDS-PAGE还是有希望的,用6%的SDS-PAGE跑下试下
我以前跑过一个600kDa的蛋白六聚体交连, 在6%的胶上是可以跑得动的
你的蛋白如果不带负电荷,又不用SDS处理,不可能在琼脂上跑出来的
不过我见过有人把琼脂混合到3-4%的SDS-PAGE里，主要目的是为了增加胶的硬度, 3%的SDS-PAGE实在太容易碎了~~
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
7楼2013-12-28 03:53:34
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