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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白电泳跑成这样是怎么回事啊? 已有4人参与

我对转化后的大肠杆菌诱导了一下,然后检测目的蛋白是否表达,但是跑出来的胶是这个样子的,根本看不出来条带,怎么回事啊?向各路大神求教。是制备样品的方法不对吗?我是取1ml菌液,12000rpm离心1min,将菌体用50ul的10%SDS重新悬浮,再加50ul的上样缓冲液,100℃加热10min,离心,上样。还是我做的胶有问题啊?我下一步应该怎么做呢?

蛋白电泳跑成这样是怎么回事啊?
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胡程

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
温室里的杂草: 金币+3, ★有帮助 2015-04-06 09:34:11
我怀疑是菌体太浓,我做样的时候是用1.2毫升菌体,40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的,上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少,10微升足够了吧
做最好的自己
2楼2015-04-05 11:07:26
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 胡程 at 2015-04-05 11:07:26
我怀疑是菌体太浓,我做样的时候是用1.2毫升菌体,40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的,上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少,10微升足够了吧

好的,谢谢,我做一下试试看
3楼2015-04-06 09:34:18
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 胡程 at 2015-04-05 11:07:26
我怀疑是菌体太浓,我做样的时候是用1.2毫升菌体,40微升5x上样缓冲液+160微升PBS稀释的,上样量是25微升。你可以试着稀释一下或者上样量减少,10微升足够了吧

我还想问一下你处理菌液的方法是加热吗?加热以后是直接上样还是离心取上清啊?
4楼2015-04-06 09:39:11
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胡程

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 温室里的杂草 at 2015-04-06 09:39:11
我还想问一下你处理菌液的方法是加热吗?加热以后是直接上样还是离心取上清啊?...

100℃煮沸,然后12000rpm,10min离心取上清(中间有菌体,不离心不好吸)
做最好的自己
5楼2015-04-06 19:08:16
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
温室里的杂草: 金币+1, ★有帮助 2015-04-08 17:22:30
样品太浓,你可以取样前测一下菌密度,按比例取菌液电泳!
I am not a hero , but I served with heroes!
6楼2015-04-06 21:41:46
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温室里的杂草

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wlt728 at 2015-04-06 21:41:46
样品太浓,你可以取样前测一下菌密度,按比例取菌液电泳!

是通过OD600测密度吗?按照什么比例取菌液啊?
7楼2015-04-07 17:20:56
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叶晓波1572

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
温室里的杂草: 金币+1, ★有帮助 2015-04-08 17:22:04
marker 与样品上样量均太多,都溢到相邻的泳道上去了。应该都减少上样量。另外,检测诱导蛋白的表达,应该加一个阴性对照(空载体转表达宿主菌的诱导样品)。
8楼2015-04-08 14:16:05
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bao可雅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人建议:你的marker跑的也有问题,只是没有样品的问题严重,不仅仅是样品的问题,你的样品浓度肯定很浓,并且你要考虑一下制胶过程中的各种成分的比例,
9楼2015-04-08 14:16:48
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