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sansejin20

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于重组质粒,对表达载体的前处理 已有1人参与

做重组质粒,对表达载体进行双酶切后又做PCR纯化,纯化这步有必要做吗?因为重复了两遍都没找出重组成功的,现在是找方法上的原因,对片段是进行双酶切后切胶回收,这个应该没什么问题,就是对表达载体的PCR纯化这步,我是怕把双酶切露出的粘性末端破坏了,所以才连不上,求助啊
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食品研究生,何去何从
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sansejin20: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-03-30 15:41:59
应该不是纯化的原因,表达载体酶切后不纯化的话,你的连接体系中就会有残留的酶切下来的片段,这样假阳性的克隆会很多,建议你在目的片段和表达载体的比例上做调整,连接之前对这两个片段再跑一次胶看看大小是否正确,同时也要注意你的感受态是否是新鲜制备并有活性的,另外,你最好做一个只加表达载体不加目的片段的对照,一一排除你失败的原因
医学&统计学
2楼2015-03-29 17:18:39
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小小cool

金虫 (正式写手)

表达载体酶切后要切胶回收的,不能pcr回收

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2015-03-29 21:11:01
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sansejin20

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小小cool at 2015-03-29 21:11:01
表达载体酶切后要切胶回收的,不能pcr回收

谢谢
食品研究生,何去何从
4楼2015-04-13 09:32:45
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