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sansejin20

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 关于重组质粒，对表达载体的前处理已有1人参与

做重组质粒，对表达载体进行双酶切后又做PCR纯化，纯化这步有必要做吗？因为重复了两遍都没找出重组成功的，现在是找方法上的原因，对片段是进行双酶切后切胶回收，这个应该没什么问题，就是对表达载体的PCR纯化这步，我是怕把双酶切露出的粘性末端破坏了，所以才连不上，求助啊

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食品研究生，何去何从

1楼 2015-03-26 10:10:08

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董博士

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【答案】应助回帖

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sansejin20: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-03-30 15:41:59

应该不是纯化的原因，表达载体酶切后不纯化的话，你的连接体系中就会有残留的酶切下来的片段，这样假阳性的克隆会很多，建议你在目的片段和表达载体的比例上做调整，连接之前对这两个片段再跑一次胶看看大小是否正确，同时也要注意你的感受态是否是新鲜制备并有活性的，另外，你最好做一个只加表达载体不加目的片段的对照，一一排除你失败的原因